反硝化聚磷菌的分離鑒定及其特性研究

張武剛 洪武林 鄭春麗

進入21世紀以來，我國地表水污染問題依然較為嚴重，湖泊（水庫）富營養(yǎng)化問題依然突出。導致水體富營養(yǎng)化的主要營養(yǎng)物質為氮和磷，而目前城市污水處理中對氮、磷的去除率并不高［1］，所以防治水體富營養(yǎng)化首要目的就是研究如何進行脫氮除磷。

反硝化聚磷菌（Denitrifying phosphate accumulating organisms，DNPAOs）是應用于反硝化除磷技術的有效菌群，它能在缺氧條件下以硝酸鹽作為電子受體進行同步反硝化（脫氮）和過量吸磷（除磷）過程［2，3］。因此，反硝化除磷技術具有反硝化脫氮時無需碳源、吸磷時無需曝氣并且排泥量少等優(yōu)點［4，5］，已成為當前廢水處理技術領域的研究熱點之一。

目前國內外對反硝化聚磷菌的種屬都有了一定的研究，而且反硝化聚磷菌的篩選技術也有了一定的發(fā)展，但較權威、特別是具有說服力的研究并不多［6］。本研究利用現(xiàn)有的反硝化聚磷菌篩選技術，從內蒙古烏梁素海湖水中找到了一株反硝化聚磷菌P1-1，通過形態(tài)、生理生化特性、BIOLOG碳源利用分析以及16S rRNA 基因序列分析對其進行了鑒定，再從生物學角度出發(fā)，對篩到的菌株進行了生物學特性研究，旨在為反硝化除磷這項新技術的應用推廣提供一定的理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學試劑 KH2PO4等試驗用到的試劑均為AR級，中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司生產；水樣取自內蒙古烏梁素海湖水。

1.1.2 培養(yǎng)基 聚磷菌分離培養(yǎng)基（L-1）［7］：3.68 g CH3COONa·3H2O、131.82mg MgSO4·7H2O、57.27mg NH4Cl、28.73mg Na2HPO4·2H2O、26.74mg K2SO4、17.2mg CaCl2·2H2O、12 g HEPES 緩沖溶液、2mL微量元素和瓊脂20g，pH7.0，用于聚磷菌的分離。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（L-1）：10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g NaCl、20 g瓊脂，pH7.0，用于反硝化聚磷菌的純化。

缺磷培養(yǎng)基（L-1）［6，8］：3.32 g CH3COONa·3H2O、152.8mg NH4Cl、17.83mg K2SO4、23mg Na2HPO4·2H2O、81.12mg MgSO4·7H2O、11mg CaCl2·2H2O、2mL微量元素和7 g HEPES 緩沖溶液，pH7.0。

富磷培養(yǎng)基（L-1）［6，8］：3.32 g CH3COONa·3H2O、91.26mg MgSO4·7H2O、305.52mg NH4Cl、25mg KH2PO4、25.68mg CaCl2·2H2O、2mL微量元素和 8.5 g PIPES緩沖液，pH7.0；可作為模擬廢水。

微量元素溶液（L-1）［6，8］：5 g EDTA、5 g MnCl2·4H2O、1.6 g CuSO4·5H2O、5 g FeSO4·7H2O、50mg CoCl2·6H2O、10mg KI、50mg （NH4）6Mo7O24·4H2O 和 50mg H3BO3。

培養(yǎng)基中所有pH都用1mol/L的氫氧化鈉溶液和1mol/L的鹽酸溶液調至7.0；培養(yǎng)基都用1×105Pa滅菌 30min。

1.1.3 主要儀器 HITACHI U-2910型紫外可見分光光度計，雷磁PHS-3C型pH計，OLYMPUS CX31雙目微生物學顯微鏡，日本電子JSM-5600 LV掃描電子顯微鏡，BIOLOG微生物自動分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、純化及篩選

1.2.1.1 菌株的分離、純化 先將水樣混合均勻，用移液管移取10mL水樣，移入盛有90mL無菌水的三角瓶中，振蕩使其混合均勻，按倍比稀釋，分別得到 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和 10-6的稀釋溶液。分別取10-3、10-4、10-5和10-6不同濃度的0.1mL水樣溶液在聚磷菌分離培養(yǎng)基上進行涂布培養(yǎng)，在恒溫隔水式培養(yǎng)箱中，30℃條件下培養(yǎng)2d。從這幾個稀釋梯度中挑選出1個最合適的梯度，要求平板上菌落分布清晰均勻（菌落數(shù)在30-300個），然后用此梯度的水樣再進行3個重復平行涂布，挑取形態(tài)清晰、易于挑取的單菌落用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行分離純化，重復3次以上菌落形態(tài)特征一致，無異常菌落出現(xiàn)，可認為是單菌落。最后挑取純化好的單一菌落接種到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 菌株的篩選 選取上面分離純化后所得的菌株，首先接種在缺磷培養(yǎng)基中，通過30℃，140r/min進行1-2d的富集預培養(yǎng)；接著取預培養(yǎng)后的5mL菌液，在1×104r/min的條件下離心2min，傾去上清液，并用無菌蒸餾水洗2次，將得到的菌株懸浮于富磷培養(yǎng)基中，整個過程在無菌操作臺上進行；然后將接種好菌株的富磷培養(yǎng)基在30℃，140r/min進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)24h，每種菌取15mL菌液，在1×104r/min的條件下離心2min，取上清液用鉬酸銨分光光度法（GB 11893-89）測定接種前后-P含量的變化；最后取除磷率高于50％的菌株進行硝酸鹽還原產氣試驗、異染顆粒染色試驗和聚-β-羥基丁酸（PHB）顆粒染色試驗，將既能過量吸磷，又具有反硝化脫氮功能并有PHB顆粒和異染顆粒的菌株定為反硝化聚磷菌（DNPAOs）［9］。

1.2.2 DNPAOs的脫氮除磷試驗 將富磷培養(yǎng)基作為模擬廢水，首先在原有富磷培養(yǎng)基的基礎上加入一定量的KNO3，使硝態(tài)氮的含量為60mL/L［6］，裝入密封的三角錐形瓶，取預培養(yǎng)24h后的DNPAOs進行無菌蒸餾水洗滌2次，離心后投入到加有KNO3的富磷培養(yǎng)基中；最后在30℃恒溫隔水式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用鉬酸銨分光光度法（GB 11893-89）測定培養(yǎng)前后磷含量的變化，并用紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）測定硝態(tài)氮含量的變化。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)及生理生化特征 將處于穩(wěn)定期的菌液制片，在光學顯微鏡下觀察，并做革蘭氏染色，利用掃描電鏡分析梯度脫水處理后的剩余菌液。菌株的生理生化特征試驗及鑒定見《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》［10］。

1.2.3.2 BIOLOG碳源利用分析 利用BIOLOG微生物自動分析系統(tǒng)，以DNPAOs對微平板上95種碳源的利用情況為基礎進行分析鑒定。

1.2.3.3 16S rRNA基因測序與構建系統(tǒng)發(fā)育樹的分析 在液體培養(yǎng)基將菌體培養(yǎng)至對數(shù)期，取1mL菌液利用試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）提取基因組DNA，用常見細菌通用引物對（正向引物27F 5'-AGAGTTYGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'［11］）擴增菌株的16S rRNA基因。PCR反應體系總共為50μL，組成為：無菌水 34μL、10×PCR Buffer 5μL、dNTPs（2.5mmol/L）4μL、引物 27F 和 1492R 各 1μL、Taq DNA聚合酶 1μL、MgCl2（25mmol/L）3μL、DNPAOs 的基因組 DNA 1μL。所用程序為 ：94℃ 3min；94℃40s，55℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴增產物的純化和測序由上海生工生物技術有限公司來完成。然后將菌株的16S rRNA 基因序列結果提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中與已有的相關序列比較，再通過ClustalX 1.8軟件進行全序列的比對［12］，最后利用MEGA3.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹［13］。

1.2.4 菌株的生物學特性研究

1.2.4.1 生長曲線的測定 細菌的生長情況采用光電比濁法進行測定，利用HITACHI U-2910型紫外可見分光光度計以OD600值表示；培養(yǎng)條件：溫度30℃，pH7.0，轉速140r/min，每2h取樣測一次，共測24h。

1.2.4.2 溫度、pH值、磷含量與菌株生長關系的確定 溫度分別設置為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，將篩選到的DNPAOs活化18h后，在每個溫度條件下以10％的接種量（接種后OD600=0.14±0.01）分別接入3份同樣的模擬廢水即富磷培養(yǎng)基中，恒溫、140r/min的條件下培養(yǎng)24h后，測定細菌懸浮液的OD600以及接種前后模擬廢水中的磷含量的變化。

pH分別設置為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，以上述相同的接種方式，30℃恒溫、140r/min條件下培養(yǎng)24h后測定細菌懸浮液的OD600以及接種前后模擬廢水中的磷含量的變化。

2 結果

2.1 反硝化聚磷菌的分離、純化及篩選

挑取的菌落經牛肉膏蛋白胨3次以上劃線后得單菌落菌株8株，按照“1.2方法”在缺、富磷液體培養(yǎng)基內培養(yǎng)后，選出除磷率在50％以上的8株菌，經硝酸鹽還原產氣試驗、PHB顆粒染色及異染顆粒染色試驗，結果見表1。

表1 菌株的篩選結果

2.2 反硝化聚磷菌的脫氮除磷試驗

經過24h缺氧培養(yǎng)后測定NO3--N和

2.3 菌株P1-1鑒定

圖1 菌株P1-1 顯微鏡照片（1000×）

2.3.1 菌株P1-1形態(tài)學特征與生理生化特性 菌株P1-1革蘭氏染色反應呈陰性，光學顯微鏡和掃描電鏡顯示該菌為典型的短桿狀（圖1，圖2），大?。?.3-0.4μm）×（1.2-2.0μm）。在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h菌落直徑小于1mm，48h菌落基本長成，菌落直徑1-2mm，不透明，米黃色，拱頂球狀，邊緣整齊，易挑起。菌株P1-1主要生理生化特性為革蘭氏陰性，氧化酶陽性，接觸酶陽性（表 2）。

圖2 菌株P1-1的掃描電鏡照片

2.3.2 BIOLOG碳源利用分析 將BIOLOG系統(tǒng)鑒定結果與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進行匹配，ID地址欄顯示最佳匹配名稱為Pseudomonas fluorescens，系統(tǒng)得到的3個重要參數(shù)均比較理想，分別為：SIM值=0.514，DIST=4.355，PROB=67.2％。BIOLOG分析結果說明該菌株與Pseudomonas fluorescens匹配度最高且達可信程度。

2.3.3 16S rRNA基因序列分析 測序獲得菌株P1-1的16S rRNA基因序列（1 440bp），GenBank序列登錄號為JN030498。菌株P1-1的16S rRNA基因序列與GenBank中已有的多株Pseudomonas fluorescens菌株相似性都在99％，并在16S rRNA基因序列同源性的基礎上構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

表2 菌株P1-1的生理生化鑒定

圖3 菌株P1-116S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株P1-1的生物學特性研究

2.4.1 菌株P1-1的生長曲線測定 菌株P1-1的生長曲線（圖4）顯示，菌株的延滯期不足2h，說明接種的菌株都處在生長旺盛期，4h以后菌株進入對數(shù)生長期，而在12h以后菌株進入了穩(wěn)定期，說明菌株P1-1易于培養(yǎng)。

2.4.2 溫度對菌株P1-1生長及除磷效果的影響 為確定菌株P1-1最佳生長溫度和最佳除磷溫度，以富磷培養(yǎng)基為反應體系，改變反應物體系的溫度，測定OD600和反應前后磷濃度的變化，每個溫度下的3個平行試驗取平均值，結果如圖5所示。菌株P1-1在溫度15-35℃生長良好，菌株的最佳生長溫度為30℃；菌株在15-35℃除磷率接近100％；40℃下不利于菌株生長而且沒有除磷效果。

2.4.3 pH對菌株P1-1生長及除磷效果的影響 為確定菌株P1-1最佳生長pH和最佳除磷條件下的pH，以富磷培養(yǎng)基為反應體系，改變反應物體系的pH，每個pH值下的3個平行試驗平均值，結果如圖6所示。菌株P1-1在pH 6.0-9.0生長良好，其中在pH 8.0下是生長最好；菌株在pH6.0-9.0磷的去除效果都很好，去除率都接近100％；在pH＜6.0或者pH＞9.0時磷的去除效果都不好，特別是在偏酸性條件下不利于菌株的生長。

圖4 菌株P1-1的生長曲線

圖5 溫度對菌株P1-1的生長及除磷率的影響

圖6 pH對菌株P1-1的生長及除磷率的影響

3 討論

本研究結果顯示，菌株P1-1具有反硝化能力，且體內都含有PHB顆粒和異染顆粒，認為菌株P1-1為反硝化聚磷菌。菌株P1-1主要生理生化特性為革蘭氏陰性，氧化酶陽性，接觸酶陽性，其基本生理生化特性與《伯杰細菌鑒定手冊》中描述的假單胞菌（Pseudomonas）［10］很相似。結合菌株 P1-1的主要形態(tài)特征、生理生化特征，BIOLOG分析結果以及16S rRNA序列分析結果，鑒定該菌株為熒光假單胞菌，命名為Pseudomonas fluorescens strain P1-1。根據(jù)馬放等［6］所報道的高效反硝化聚磷菌的除磷和脫氮效果，本試驗篩選到的菌株已經表現(xiàn)出了較好的反硝化除磷能力。雖然菌株P1-1在缺氧條件下具有反硝化過量吸磷的能力，但是缺氧條件下磷的去除效果沒有好氧條件好，這是由于利用硝態(tài)氮吸磷時可能不如利用分子氧效率高［14］。根據(jù)報道［4，5］，反硝化除磷技術具有脫氮時無需碳源、吸磷時無需曝氣并且排泥量少等優(yōu)點，而反硝化聚磷菌在反硝化除磷技術中起到了關鍵作用。因此篩選分離反硝化聚磷菌對研究反硝化除磷技術，提高反硝化除磷能力具有重大意義。

4 結論

參考已有的反硝化聚磷菌的篩選方法，利用聚磷分離培養(yǎng)基進行初篩，大大提高了篩菌的效率，縮短了時間。從內蒙古烏梁素海湖水中篩選到一株反硝化聚磷菌，鑒定為熒光假單胞菌，并命名為熒光假單胞菌P1-1（Pseudomonas fluorescens strain P1-1）。菌株P1-1最佳生長和除磷的溫度是30℃，pH為8.0，除磷率接近100％，具有較好的應用前景。

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