異檸檬酸脫氫酶1基因多態(tài)性對非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響

王 艷 Amit K Mitra Jatinder K Lamba 姬懷雪

1.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇徐州 221006；2.美國明尼蘇達大學藥學院，美國明尼蘇達 55108

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一組高度異質性的惡性血液腫瘤。阿糖胞苷是治療AML最重要的一線化療藥物，能提高患者生存率[1-2]。然而，阿糖胞苷耐藥的產生一直是影響AML患者生存率的瓶頸[2]。因此，鑒定影響阿糖胞苷耐藥性的關鍵基因的變異，對于避免阿糖胞苷耐藥性的發(fā)生有重要作用。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）是近期發(fā)現(xiàn)的一種NADP依賴型的異檸檬酸脫氫酶[3]。研究發(fā)現(xiàn)，IDH1基因突變致與急性白血病的發(fā)生與不良預后密切相關[4]。然而，IDH1對非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響目前并不清楚。本研究旨在探討IDH1對非洲人群AML患者阿糖胞苷耐藥性的影響，為提高該人群AML患者阿糖胞苷的療效，降低不良反應奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

應用來自國際人類基因組計劃60個非洲人（YRI）EBV病毒轉化的淋巴母細胞系（lymphoblastoid cell line，LCL）。上述細胞株購自美國Coriell醫(yī)學研究所。將上述細胞株置于含有L-谷氨酰胺（Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD）的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加15%熱滅活血清37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)[5]。

1.2 阿糖胞苷的細胞耐藥性檢測

阿糖胞苷耐藥性檢測參照文獻[6]方法進行。予不同濃度的阿糖胞苷（1，5，40，80 μmol/L）加入細胞中共培養(yǎng)72 h后，應用alamar Blue試劑盒（Biosource international，Camarillo，CA）參照制造商說明書檢測細胞存活曲線、細胞增殖和細胞毒性。梯形法計算阿糖胞苷曲線下面積（AUC）判斷該藥的耐藥性（以更高的AUC表示），AUC進行Log2轉換后統(tǒng)計分析[6]。

1.3 IDH1基因多態(tài)性檢測

DNA樣本來自HapMap非洲人群的LCL細胞株。參照文獻[7]，針對IDH1突變熱點區(qū)域設計引物，由明尼蘇達大學生物醫(yī)學基因組學中心合成。引物序列如下：

正向：5'CTCAGAGCCTTCGCTTTCTG3'；

反向：5'TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT3'。 Taqman PCR反應條件：95℃預變性7 min；然后95℃變性30 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 40 s，35 個循環(huán)后，70℃延伸10 min，反應產物4℃保存。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)目的條帶樣本由明尼蘇達大學生物醫(yī)學基因組學中心直接測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（NCBI）中序列比對（BLAST）比較。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件R軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用 t檢驗。連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）與單倍型分析、單倍型人群頻率估算采用Haploview 4.2分析。IDH1 SNPs的基因型、最小等位等位基因與阿糖胞苷AUC的分析采用Kruskal-Wallis檢驗及Wilcox檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本研究發(fā)現(xiàn)，非洲人群樣本中，IDH1 rs10173938、rs10192397與阿糖胞苷更高的AUC相關（提示耐藥）。其中，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統(tǒng)計學意義 [rs10173938：AA 比（AC+CC），P=0.040]。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統(tǒng)計學意義[（rs10192397：（CC+CT）比 TT，P=0.036]。 見表 1。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，IDH1 的 SNPs（rs10173938、rs10192397）變異與非洲人群AML患者的阿糖胞苷耐藥性有關。IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者對阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10173938的最小等位基因A可能是該部分人群對阿糖胞苷耐藥的風險因子。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10192397的最小等位基因T可能是該部分人群對阿糖胞苷耐藥的風險因子。具體的功能及意義在進一步研究中。

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態(tài)性對阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態(tài)性對阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

注：P1為 AA 比（AC+CC）；P2為（CC+CT）比 TT

rs10173938 rs10192397內顯子內顯子AA（n=16）AC（n=32）CC（n=9）CC（n=13）CT（n=34）TT（n=13）3295.371±658.214 2833.301±497.002 3195.382±776.748 2857.324±540.578 2780.298±630.892 3285.368±585.815 P1=0.040 P2=0.036 rs編號 定位 基因型 阿糖胞苷曲線下面積 P值

IDH1基因突變是急性白血病的發(fā)生及不良預后的重要因素。IDH1密碼子132R的突變能誘發(fā)細胞因子自主性，阻礙造血干細胞分化，誘導AML發(fā)生[7-8]。近期文獻發(fā)現(xiàn)，攜帶有IDH1密碼子132R和IDH2密碼子R172突變基因的正常核型急性髓細胞白血?。–N-AML）患者或同時伴有IDH及NPM1變異的老年CN-AML患者應用阿糖胞苷化療后易發(fā)生阿糖胞苷耐藥，完全緩解率降低[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，IDH1的SNPs（rs10173938、rs10192397）與非洲人群樣本中阿糖胞苷的耐藥性有關。進一步證明，IDH1基因突變是導致AML患者不同的預后及阿糖胞苷耐藥發(fā)生的重要因素。具體功能及機制需要大樣本研究進行證實。

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