中風膏對大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗死體積及細胞凋亡的影響1）

劉志軍，楊瑞龍，楊 濤，胡敏棣，竇友義，張 謙，趙俊喜

中風膏是在古方“佛手散（當歸、川芎）”基礎上重用岷當歸（達藥典規(guī)定的6倍），配伍赤芍、黃芪、水蛭、羌活和甘草等制成，具有活血化瘀及調節(jié)免疫功能的作用［1］，對中風有良好臨床療效［2，3］。本研究旨在探討中風膏對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及抗凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和主要試劑 健康雌雄各半SPF級SD大鼠140只，體重280g～320g，鼠齡3～4個月。購于甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心，許可證號：SCXK（甘）2004－0006。

中風膏為甘肅省中醫(yī)醫(yī)院院內制劑，由醫(yī)院制劑室提供。藥品批文號：甘藥制字Z04000839，生產批號：20090412。配方：岷當歸、川芎、赤芍、黃芪、水蛭、羌活、甘草等。工藝：將岷當歸精餾后，取當歸藥渣與川芎、赤芍、黃芪、水蛭、羌活、甘草混合，經水提、醇沉、過濾、濃縮后與當歸精餾產生的揮發(fā)油混合，滅菌制成膏劑，成品包裝。規(guī)格：10g。每克相當于生藥9g（依據中華人民共和國藥典2000年版）。

脫氧核苷酸末端轉移酶介導的DNA原位末端標記法（TUNEL），原位細胞凋亡檢測成套試劑盒由德國羅氏公司提供。2，3，5－三苯基四氮唑（TTC）由武漢博士德生物科技有限公司提供。

1.2 動物分組及處理 用數字表法將大鼠隨機分為假手術組（15只），模型組、中風膏大劑量組、中風膏小劑量組，各35只。除假手術組外，各組又分為TTC染色組及凋亡檢測組，TTC染色組再隨機分為缺血再灌注24h、48h及72h3個時間點，凋亡組隨機分為缺血再灌注4h、24h、48h和72h4個時間點，各個時間點5只。

給藥方法：中風膏大、小劑量分別為1.8g／（kg·d）和0.9 g／（kg·d）。造模前連續(xù)灌胃7d及再灌注1h后灌胃給藥，每天上午、下午各一次；模型組每次予以同等容積生理鹽水灌胃。1.3 造模方法 參照Longa等［4］線栓造模方法并進行部分改良建立大鼠右側腦缺血再灌注模型。手術分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），結扎并切斷頸外動脈及其分支，電凝燒灼頸內動脈顱外分支翼腭動脈，以阻斷顱外來源的側支循環(huán)。

動物模型成功的評價標準：手術后以大鼠清醒后出現同側Honer征（梗死灶同側瞳孔縮小，眼裂變，眼球內陷）、自主運動無方向性、提尾向右側旋轉、自行向右轉圈為判斷模型成功的標準。淘汰的大鼠隨機補充，保證每組5只。

1.4 標本取材

1.4.1 TTC染色組大鼠腦標本取材 腦缺血2h再灌注24h、48h、72h各時間點用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉大鼠后，沿胸骨旁線剪開胸腹腔，暴露心臟、肝臟及主動脈起始端，取灌注針自心尖向右上45度進針至主動脈起始端，固定針頭，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水（200～250）mL至肝臟變白，自右心耳流出的液體清亮后接著灌注4%多聚甲醛約300mL，先快后慢，至大鼠四肢強直僵硬后停止灌注，拔出穿刺針?？焖贁囝^取腦，置于10%多聚甲醛室溫下固定保存。

1.4.2 凋亡組大鼠大腦標本取材 腦缺血2h再灌注4h、24 h、48h、72h各時間點用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉大鼠。打開胸腔，從左心室插入注射針頭，于右心耳部處剪一小口，向內先快速滴入生理鹽水10min，然后緩慢滴入，至右心耳流出液變清亮，肝臟顏色變白為止。然后注入4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液約250mL，灌流固定約30min，至肝臟變硬。用大剪刀沿大鼠頸部斷頭取腦，除去小腦和腦干，取視交叉前后20mm～30mm冠狀切片，放入10%甲醛中固定，24h內石蠟包埋。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 神經功能缺損評分 參照 Longa［4］和 Bederon［5］的5分制評分方法標準，在缺血再灌注各時間點進行神經功能缺損評分。

1.5.2 TTC染色檢測腦梗死體積 將所取大腦置于－20℃冰箱中速凍20min，距額極3mm將大腦作連續(xù)2mm冠狀切片，共6片，然后將腦片放入2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃恒溫孵育1h，轉入4%多聚甲醛中6h后觀察。應用病理圖像分析儀測量腦梗死面積，根據公式 V＝（A1＋…An）t／2算出梗死體積。其中V為梗死體積，A為梗死面積，t為切片厚度。

1.5.3 脫氧核苷酸末端轉移酶介導的DNA原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡 將石蠟包埋標本行連續(xù)冠狀切片，厚3μm，每20片取一片檢測細胞凋亡。光鏡下陽性細胞核染成棕黃色。每張切片在400倍光鏡下隨機選取5個不重疊的視野，計算陽性細胞數取平均值。

2 結 果

2.1 中風膏對大鼠神經功能缺損評分的影響 假手術組大鼠沒有神經功能缺損表現，評分均為0分。模型組、中風膏大小劑量組均出現了不同程度的神經功能缺損癥狀，神經功能缺損評分隨時間推移而逐漸降低。在缺血再灌注24h后，藥物組神經功能缺損評分均小于模型組（P＜0.05），但中風膏大、小劑量組間差異不明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠再灌注各時間點神經缺損評分比較（±s） 分

表1 各組大鼠再灌注各時間點神經缺損評分比較（±s） 分

組別 4h（n＝5） 24h（n＝10） 48h（n＝10） 72h（n＝10）假手術組0000模型組 2.56±0.55 2.78±0.63 2.12±0.73 1.57±0.68中風膏小劑量組 2.54±0.57 1.98±0.551） 1.56±0.591） 0.93±0.521）中風膏大劑量組 2.48±0.34 1.80±0.591） 1.44±0.521） 0.88±0.561）在相同時間點，與模型組組比較，1）P＜0.05

2.2 中風膏對腦梗死體積的影響 假手術組無梗死灶。模型組隨缺血再灌注時間延長，腦梗死體積逐漸增加。缺血再灌注24h、48h、72h時間點，藥物組梗死體積均小于模型組（P＜0.05），但中風膏大、小劑量間差異不明顯。詳見表2。

表2 各組大鼠再灌注各時間點腦梗死體積比較（±s） cm3

表2 各組大鼠再灌注各時間點腦梗死體積比較（±s） cm3

組別 n 24h 48h 72h假手術組5 0 0 0模型組 5 0.123 9±0.023 0 0.125 4±0.020 7 0.130 1±0.029 9中風膏小劑量組 5 0.078 6±0.033 91） 0.073 2±0.021 71） 0.071 3±0.015 31）中風膏大劑量組 5 0.073 5±0.037 11） 0.071 4±0.022 11） 0.066 1±0.020 91）在相同時間點，與模型組組比較，1）P＜0.05

2.3 中風膏對細胞凋亡的影響 光鏡下正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核為深淺不一的棕褐色。TUNEL法染色陽性的凋亡細胞主要位于額頂皮質梗死灶與正常腦組織交界的周邊區(qū)。在假手術組凋亡細胞很少，藥物組和模型組凋亡細胞均顯著高于假手術組（P＜0.01）；缺血再灌注4h，凋亡細胞開始增多，24h達高峰，之后逐漸減少。藥物組與模型組相比，再灌注24h凋亡細胞明顯下降，并持續(xù)到再灌注72h（P＜0.05）。中風膏大、小劑量組比較無明顯差異。詳見表3。

表3 各組大鼠再灌注各時間點凋亡細胞數比較（±s） 個／400倍視野

表3 各組大鼠再灌注各時間點凋亡細胞數比較（±s） 個／400倍視野

組別 n 4h 24h 48h 72h假手術組5 2.0±0.28 3.5±0.35 2.5±0.31 1.5±0.28模型組 5 7.6±0.421） 16.3±0.931） 12.7±0.671） 11.7±0.571）中風膏小劑量組 5 7.4±0.401） 12.4±0.721）2） 9.5±0.731）2） 8.1±0.621）2）中風膏大劑量組 5 7.3±0.451） 11.9±0.621）2） 8.8±0.621）2） 7.5±0.481）2）在相同時間點，與假手術組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

急性腦缺血后由于腦組織缺血缺氧，產生一系列神經功能缺損癥狀，嚴重影響患者的生存質量，甚至生命。根據神經功能缺損癥狀評分，可準確評價藥物治療的效果及判斷患者的轉歸。因此，神經功能缺損評分無論在臨床及動物實驗中，被廣泛采用。Longa和Bederon的5分制評分方法是公認的大鼠MACO模型神經功能缺損癥狀評分方法。本研究假手術組僅僅將線栓插入大鼠頸內動脈6mm，并未達到引起缺血的深度，所以沒有出現相應的神經癥狀，神經學評分為0分，從而排除了手術因素對大鼠神經學評分的影響。研究結果表明藥物分組因素、時間因素對大鼠的神經學評分都能產生顯著的干預作用，模型組和給藥組（中風膏大、小劑量組）出現了不同程度的神經功能缺損癥狀，神經功能缺損評分隨時間推移而逐漸降低。中風膏能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經損傷癥狀，在缺血再灌注24h后，給藥組神經功能缺損評分均小于模型組（P＜0.05），但未顯示出量效關系。應用MACO模型和TTC染色觀察腦梗死體積，是目前國內外研究腦缺血再灌注損傷病理機制和評估藥效的常用方法。本研究結果顯示，假手術組無梗死灶；缺血再灌注24h、48h、72h時間點，藥物組梗死體積均小于模型組（P＜0.05），但未顯示出量效關系。中風膏對腦缺血再灌注損傷有神經保護作用。

在腦缺血急性期，神經元壞死與凋亡并存，細胞壞死位于缺血中心區(qū)，細胞凋亡主要出現在缺血半暗帶。而在腦缺血的遲發(fā)性神經元死亡期，則以細胞凋亡為主。凋亡可能決定了最終梗死體積［6］。本研究結果顯示，凋亡細胞主要位于梗死灶與正常腦組織交界的周邊區(qū)。在假手術組凋亡細胞很少，缺血再灌注模型組凋亡細胞顯著高于假手術組（P＜0.05）；缺血再灌注4h，凋亡細胞開始增多，24h達高峰，之后逐漸減少。提示中風膏通過抑制缺血再灌注大鼠腦缺血區(qū)細胞凋亡，起到腦保護作用。

本實驗更為全面深入闡明了中風膏神經保護作用及機制。但對其量效關系沒有明確的結論。另外，中風膏抗凋亡路徑尚不清楚，這些問題需進一步研究。

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