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    腎活檢標本的制備

    2013-09-12 03:41:34武芳芳郎冬梅
    實用醫(yī)藥雜志 2013年8期
    關鍵詞:切片機光鏡電鏡

    孫 璟,武芳芳,郎冬梅

    腎活檢病理不同于常規(guī)病理,除了光學顯微鏡外,還需要借助免疫病理和電鏡的觀察,才能作出病理診斷。在腎穿刺活檢標本制片過程中,組織的前期處理對標本制作的效果起著關鍵性作用[1]。根據(jù)筆者所在科近年來50例腎活檢標本制備體會進行分析,現(xiàn)將在長期實踐中摸索出來的一套較好的制備方法介紹如下。

    1 標本取材前準備

    腎活檢標本要進行3種病理檢查,因此取出腎標本后就立即分為3部分送檢。各種標本固定液均應在穿刺前按不同檢視方法置于干凈的小瓶內(nèi)待用。①光鏡:清潔的5 ml小瓶,裝滿FAA混合固定液(配方為10%甲醛10 ml、冰醋酸5 ml和90%乙醇溶液85 ml)蓋緊常溫保存;②免疫熒光:清潔的5 ml小瓶,瓶中放入浸濕生理鹽水的紗布,冰桶內(nèi)保存?zhèn)溆?;③電鏡:清潔的1 ml的離心管,加滿2%的戊二醛蓋緊置冰桶內(nèi)保存?zhèn)溆肹2]。

    2 標本的判斷與分割

    腎穿刺一般應用穿刺針在B超定位下進行。一次可獲取1.0~1.5 cm腎組織。肉眼觀腎組織髓質(zhì)顏色暗紅,皮質(zhì)稍淺;在放大鏡下,皮質(zhì)部分可見到腎小球呈小紅點結(jié)構(gòu),放入固定液中,可沉于瓶底。另外,在取材時應注意標本的鑒別,如肌肉組織的顏色與腎組織的顏色相似,相對密度也和腎組織差不多,但其看不到腎皮質(zhì)小紅點。脂肪組織呈黃白色,相對密度小,漂浮于固定液表面。結(jié)締組織呈灰白色,較腎組織質(zhì)地柔韌,不易切割。如發(fā)現(xiàn)無腎小球或不是腎組織,則應重新穿刺取材。

    常規(guī)在確定為腎組織標本后,應立即分割進行光鏡、免疫熒光或電鏡檢查。操作中需注意標本未固定時,攝取標本動作一定要輕,切勿擠壓,避免人為破壞腎組織結(jié)構(gòu),應在短時間分切標本,不宜過長時間將標本暴露在空氣中或強光下,以保持標本的濕潤性,否則標本將會縮小、干枯。方法如下:將腎穿刺標本輕輕放在軟木板上,分清皮質(zhì)端和髓質(zhì)端,用鋒利的小刀進行切割,自皮質(zhì)端切下1~2 mm(分配1~2個腎小球)供電鏡檢查用,依次再切下3~4 mm(分配1~5個腎小球)供免疫熒光檢查用,其余大部分(分配不少于10個腎小球)供光鏡檢查,如取材標本較少,應先滿足染色光鏡標本,其次為免疫病理標本。筆者所在科一般制作冰凍切片7~8 張,厚度為 3~4 μm,做 IgG、IgA、IgM、C3、Clq、C4 等抗體檢查,石蠟包埋切片 2~3 μm, 分別做常規(guī) HE染色,PAS,Masson、PASM以及剛果紅和甲基紫等特殊染色。

    標本分割后應立即放于事先準備好的容器內(nèi),做免疫熒光的標本,放在經(jīng)生理鹽水浸溫的紗布上,連同紗布置于干凈容器內(nèi),及時經(jīng)OTC包埋劑包埋切片。光鏡標本即放進FAA混合固定液內(nèi),電鏡標本立即放入2.5%戊二醛內(nèi)于4℃冰箱內(nèi)固定。標本裝瓶后應及時加蓋,并在瓶上寫清患者姓名、科室及床號。若未能及時送檢標本應置于冰箱中保存待檢。

    3 標本的具體制備方法

    3.1 免疫熒光的制片 方法是腎臟病理學中最重要的方法,最好用冷凍切片機,冷凍切片的腎組織新鮮,抗原保存良好,若暫時不能切片,應將標本放在-70℃低溫冰箱內(nèi)保存。將標本置于冷凍切片機的冷凍頭上,加少許OTC包埋劑,于冷室內(nèi)-20℃切片,厚度要求3~4 mm附貼于載玻片上需要10片以上備用。光鏡觀察切片有無腎小球(不染色),如有腎小球,則視需要選擇相應抗體的種類,切出相應數(shù)量的片子,剩余腎組織放入冰箱備用。

    3.2 石蠟包埋制備方法 組織的固定:腎組織在固定液內(nèi)于室溫下固定45 min。脫水、透明、浸蠟、包埋:①梯度酒精脫水,以70%-80%-90%-無水乙醇,每梯 2缸,每缸 20 min,二甲苯透明,分2缸,每缸10 min;②浸蠟包埋:優(yōu)質(zhì)石蠟(58~62℃)2缸,每缸30 min后包埋。切片:修理蠟塊,置于冰箱預冷40 min,在切片機上切出2~3 μm的切片。在實踐中發(fā)現(xiàn)石蠟切片時需要注意室溫不能過高,應保持在25~28℃之間,否則蠟塊易溶,不易制片。

    3.3 電鏡標本制備方法 ①取材:標本要求含有腎小球;②固定:標本立即放入2.5%戊二醛內(nèi)于4℃冰箱內(nèi)固定4 h后入0.05 mol/L磷酸緩沖液沖洗3 h,再入1%鋨酸于室溫下固定1 h;③脫水包埋:依次用50%-65%-75%-85%-95%-無水乙醇脫水,30 min/次;氧化丙烯酸浸透 3 次,15~30 min/次;浸透:浸透1 h;固化,使之聚合變硬,呈淡黃色透明塊狀;④超薄切片:將包埋塊修整,用切片機制成超薄片[2]。許多類型的腎小球疾病診斷必須以電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)或免疫電鏡結(jié)果,才能得出正確診斷。

    圖1 光鏡標本

    圖2 冰凍標本

    4 結(jié)果

    筆者所在科所處理的98%左右的腎穿刺標本都能確保光鏡(圖 1)、冰凍(圖 2)、電鏡(圖 3)標本都有腎小球。 按上述程序操作的特殊染色對比鮮艷,效果好,完全可以滿足病理診斷。

    圖3 電鏡標本

    5 體會

    結(jié)合50例腎穿刺活檢病理標本制備情況,現(xiàn)總結(jié)體會如下:首先要進行腎活檢標本的判斷和辨認,因腎穿組織較普通病理體積較小,組織塊一定要包好。其次組織在標本分割時要注意動作要輕柔,切片刀要鋒利,切片要平整。再次,標本根據(jù)需要選擇固定液進行固定。在此需要注意的是固定液應為標本體積的10倍。標本裝瓶后應及時加蓋。最后,進行切片。在標本制片過程中,組織的前期處理對組織制片的效果起到關鍵作用。所以,在腎穿刺活檢組織標本制片中一定要掌握時間,才能保證做出良好的腎臟病理切片,更好的為臨床醫(yī)師診斷提供幫助。

    [1]鄒萬忠.腎活檢病理診斷標準指導意見[J].中華腎臟病雜志,2001,17(3):270-275.

    [2]王伯沄,李玉松,黃高昇,等.病理學技術[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.948-952.

    [3]龔志錦.病理組織制作和染色技術[M].上海:上海科學技術出版社,1994.359.

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