負(fù)壓空化法提取五倍子單寧酸的響應(yīng)面法優(yōu)化

閔凡芹，張宗和，2，秦 清，2，葉建中，王成章，2*

1中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，南京 210042;2南京龍源天然多酚合成廠，南京 210032

五倍子為倍蚜類昆蟲在漆樹科(Anacadi-aceae)植物鹽膚木Rhus chinensis Mill.、青麩楊Rhus potanninii Maxin.或紅麩木復(fù)葉主軸兩側(cè)上形成的蟲癭，為重要的中藥材。其主要的藥效成分五倍子單寧酸是一類水解單寧，是沒食子酸與不同構(gòu)型的葡萄糖結(jié)合的混合物，以五倍酰葡萄糖為核心，在C2、C3、C4以縮酚鍵連接幾個不同數(shù)目的倍?；Y(jié)構(gòu)［1］。五倍子單寧酸具有廣泛的生物活性，目前主要用于酒類和飲料的澄清劑、印染、冶金、醫(yī)藥等行業(yè)［2，3］，其水解產(chǎn)物沒食子酸則是一種重要的化工原料。

目前從五倍子中提取單寧酸多采用浸漬法、溶劑回流提取法等，其操作簡單，但具有提取率低、有機溶劑消耗量大等缺點，新型的提取方法如超聲波輔助提取［4］、微波輔助提取等雖然能夠在一定程度上提高提取率，但存在設(shè)備昂貴，安全性差等不足。負(fù)壓空化提取法通過在常規(guī)提取器上引入真空系統(tǒng)，以抽氣的形式激發(fā)的微小氣泡(空化核)在瞬間潰滅，使其周圍產(chǎn)生強烈的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)加速原料組織中有效成分的溶出，從而實現(xiàn)了低溫、快速提取，可以有效防止提取過程中熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分解，是一種新型的提取方法［5，6］。負(fù)壓沸騰提取與相應(yīng)曲面設(shè)計相結(jié)合在五倍子中單寧酸的提取中的應(yīng)用尚未見報道，本研究為科學(xué)合理利用五倍子資源及工業(yè)化生產(chǎn)單寧酸奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

原料:五倍子藥材為南京龍源天然多酚合成廠提供。試劑:Folin-Denis試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品購于南京林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;Na2CO3為分析純。儀器:HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋;UV-2012PC型紫外分光光度計;WK-400A型高速藥物粉碎機;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;島津ALE-200電子天平;SHB-3型循環(huán)水多用真空泵;TG1650-WS離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.0499 g單寧酸，定容于100 mL的容量瓶中。取6支25 mL比色管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋至10 mL，再各加入1 mL Folin-Denis試劑及2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的Na2CO3溶液，在沸水中加熱1 min，冷卻并稀釋至25 mL，靜置30 min。630 nm下進行光譜掃描，以吸光度為縱坐標(biāo)，單寧酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=69.848X+0.0011，相關(guān)系數(shù) R=0.9993。

1.2.2 單寧酸的負(fù)壓提取流程

將五倍子藥材去蟲尸，經(jīng)高速藥物粉碎機粉碎后備用。稱取10 g五倍子粉末于圓底燒瓶中，按一定的液固比加入水溶液，采用水浴加熱，回流管上端接真空泵，控制真空度使提取液微沸(提取溫度為50℃時，真空度0.088 mpa左右;提取溫度為55℃時，真空度0.085 mpa左右;提取溫度為60℃時，真空度0.080 mpa左右)，提取一定時間后離心分離上清液。上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用移液管精密移取1 mL于比色管中，先加水稀釋至10 mL，后分別加入1 mL Folin-Denis試劑、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的Na2CO3溶液，沸水中加熱1 min，冷卻并稀釋至25 mL，靜置30 min。于630 nm下測定吸光度值。

1.2.3 響應(yīng)面法中心組合設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、液固比、提取時間3因素，采用Box-Behnken實驗設(shè)計優(yōu)化負(fù)壓提取五倍子中單寧酸的主要工藝參數(shù)，實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面3因素3水平試驗設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3 回歸模型的建立及其顯著性分析

以提取溫度(X1)、液固比(X2)、提取時間(X3)為自變量，單寧酸提取率為響應(yīng)值(Y)，進行響應(yīng)面分析，試驗結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding extraction yields

9 0-1 -1 63.96 10 0 1 -1 60.82 11 0 -1 1 62.63 12 0 1 1 63.92 13 0 0 0 67.78 14 0 0 0 67.20 15 0 0 0 66.10 16 0 0 0 67.58 17 0 0 0 68.07

對表2中試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二元多次回歸方程 Y=67.33+0.18X1-0.33X2+0.19X3+0.36X1X2+0.89X1X3+1.11X2X3-2.04X12-1.42X22-3.08。對模型進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of items in regression equation

從表 3可以看出，模型的 F回歸=19.84，P=0.0003＜0.001，表明實驗所采用的二次模型是極顯著的，在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。失擬項P=0.6807＞0.05，對模型是有利的，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。在交互項中提取溫度和提取時間、液固比和提取時間兩項達到顯著水平(P＜0.05)，在二次項中提取溫度、液固比、提取時間三項對單寧酸提取率的影響均達到顯著水平，其中提取溫度和提取時間的影響極顯著(P＜0.001)。通過比較回歸方程中一次項系數(shù)絕對值的大小，可判斷因素影響的主次性［8］。在負(fù)壓提取五倍子單寧酸工藝中，三個考察因素對單寧酸提取率的影響大小分別為液固比＞提取時間＞提取溫度。由以上分析可知，各因素對五倍子中單寧酸提取率的影響復(fù)雜，并非簡單的線性關(guān)系［9］。

1.4 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

根據(jù)響應(yīng)面回歸分析和優(yōu)化模型繪制自變量交互作用對單寧酸提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖，如圖1～3所示。

由圖1可見，交互項X1X2等高線形狀偏向于圓形，表明提取溫度與液固比這兩項的交互作用并不顯著，說明這兩者相互作用對單寧酸提取率的影響較小。從三維曲面圖可以看出提取溫度和液固比對單寧酸提取率的影響都是先增加后降低，從等高線變化趨勢圖可知，提取溫度在52.5～57.5℃，液固比在22.5 ～27.5∶1(mL∶g)時，單寧酸提取率存在最大值。

由圖2可見，交互項X1X3即提取溫度和提取時間存在較為顯著的交互作用，表現(xiàn)為等高線圖呈橢圓狀，說明當(dāng)提取溫度較低時，延長負(fù)壓提取的時間可有效提高單寧酸的提取率，而當(dāng)提取溫度較高時，單寧酸溶解擴散速度加快，可在較短時間內(nèi)完成五倍子中單寧酸的提取。從三維曲面圖可以看出隨著提取溫度和提取時間的增加，單寧酸提取率的變化趨勢都是先增加后降低，從等高線變化趨勢圖可知，提取溫度在52.5～57.5℃，提取時間在25～35 min時，單寧酸提取率存在最大值。

由圖3可見，交互項X2X3即液固比與提取時間亦存在較為明顯的相互作用，等高線圖為橢圓狀，說明這兩者的交互作用對單寧酸提取率有較大影響:液固比較大時，達到擴散溶解平衡所需要的時間也長，因而應(yīng)相應(yīng)增加提取時間，反之，液固比較小時，提取的時間可適當(dāng)縮短。從三維曲面圖可以看出隨著液固比和提取時間的增加，單寧酸提取率的變化趨勢也成先增加后降低的拋物線，從等高線變化趨勢圖可知，液固比在23～26∶1(mL∶g)，提取時間在25～35min時，單寧酸提取率存在最大值。

1.5 最優(yōu)提取工藝參數(shù)的確定及驗證實驗

通過上述回歸模型計算得到五倍子中單寧酸負(fù)壓提取的最佳工藝條件為提取溫度55.19℃、液固比24.47∶1(mL∶g)，提取時間 30.18 min，此條件下模型預(yù)測的單寧酸提取率為67.353%?？紤]到實驗的可操作性［10］，將以上最優(yōu)參數(shù)分別調(diào)整為提取溫度 55 ℃、液固比24∶1(mL∶g)，提取時間30 min，并據(jù)此進行結(jié)果驗證。平行測定3次所獲實際單寧酸平均提取率為66.56%，與模型預(yù)測值的相對誤差為1.18% ＜5%，因此采用模型預(yù)測得到的提取條件參數(shù)可靠，有一定指導(dǎo)意義。

圖1 提取溫度和液固比交互影響的曲面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contours of the effect of temperature and solvent to material ratio

圖2 提取溫度和提取時間交互影響的曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contours of the effect of temperature and extraction time

圖3 液固比和提取時間交互影響的曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contours of the effect of solvent to material ratio and extraction time

2 結(jié)論

采用中心組合設(shè)計對影響負(fù)壓提取五倍子單寧酸的關(guān)鍵工藝參數(shù)提取溫度、液固比、提取時間進行了3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析，建立了以五倍子中單寧酸提取率為響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型:Y=67.33+0.18X1-0.33X2+0.19X3+0.36X1X2+0.89X1X3+1.11X2X3-2.04X12-1.42X22-3.08X32，模型回歸方程顯著，可用于實際預(yù)測。通過響應(yīng)面法優(yōu)化負(fù)壓提取五倍子單寧酸的最佳工藝條件為:提取溫度55℃、液固比24∶1(mL∶g)、提取時間30 min，在此提取工藝下，單寧酸提取率為66.56%。采用響應(yīng)面法對負(fù)壓提取五倍子單寧酸的工藝進行優(yōu)化，對五倍子資源的綜合利用和負(fù)壓提取工藝的產(chǎn)業(yè)化具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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