生物肥料多功能芽孢桿菌的篩選及其作用機(jī)理研究

張艷群，來(lái)航線，韋小敏，王旭東

(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌712100)

生物有機(jī)肥是多種有益微生物菌群與有機(jī)肥結(jié)合形成的新型、高效、安全的微生物－有機(jī)復(fù)合肥料。施入后能提高肥料利用率，調(diào)節(jié)植株代謝，增強(qiáng)根系活力和養(yǎng)分吸收能力［1－3］。目前，運(yùn)用生物肥料中的有益微生物防治植物病害以及生物凈化環(huán)境已成為研究熱點(diǎn)，其中具有產(chǎn)孢功能，耐熱和耐干旱的芽孢桿菌越來(lái)越為人們所關(guān)注［4－6］。

芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌或球狀細(xì)菌。具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)快速、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［7］，加之易于制成粉劑，便于儲(chǔ)藏運(yùn)輸，利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，具有很好的應(yīng)用前景和極大的開發(fā)潛力。

植物病害生防芽孢桿菌的研究開發(fā)應(yīng)用目前已取得了令人矚目的成就，但仍存很多問(wèn)題，如功能菌種單一，效果不穩(wěn)定［8］。目前，國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于PGPR類制劑，而且多見(jiàn)于生物防治等領(lǐng)域［9－10］。大多數(shù)研究都集中于單一功能生物因子或同一功能的不同生物因子的功能菌群的研究［8］，對(duì)芽孢桿菌的研究相對(duì)較少，尤其對(duì)多功能芽孢菌株篩選或功能芽孢菌株的復(fù)配組合研究甚少。因此，本研究以芽孢桿菌的抑病、促生、活化養(yǎng)分及改善微生物區(qū)系四個(gè)方面為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)、盆栽促生試驗(yàn)及土壤養(yǎng)分和微生物類群的測(cè)定，旨在篩選多功能芽孢桿菌，通過(guò)組合得到最優(yōu)芽孢桿菌組合，為功能型生物有機(jī)肥的研發(fā)和生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株 芽孢桿菌:菌株B05、B06、B09，均為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供的可作為生物肥料開發(fā)的功能菌株，分別為蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus，CICC編號(hào)為21688)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis，CICC編號(hào)為63501)和蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus，CICC編號(hào)為21687)，其余的6株芽孢桿菌為側(cè)孢芽孢桿菌B01(Bacillus laterosporus)、枯草芽孢桿菌B02(Bacillus subtilis)、枯草芽孢桿菌B03(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌B04(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌B07(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌B08(Bacillus natto)，均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定及保藏的可用于肥料開發(fā)應(yīng)用的芽孢菌株。

病原真菌:茄鐮刀菌F01、鐮刀菌F02、尖孢鐮刀菌F03、尖孢鐮刀菌F04、腐皮鐮刀菌F05、腐皮鐮刀菌 F06、甜瓜蔓枯病菌 F07、甜瓜根腐病菌F08，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物課題組薛泉宏教授提供。F01、F02為土豆致病菌，F(xiàn)03～F06為黃瓜致病菌，F(xiàn)07、F08為甜瓜致病菌。

1.1.2供試植物 小白菜品種“金早生小白菜F1”由陜西秦興種苗有限公司提供。盆栽試驗(yàn)土壤采自西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田，為摟土。

1.1.3供試培養(yǎng)基［11］改良牛肉膏－蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)用于芽孢桿菌和病原細(xì)菌的培養(yǎng)與保存;牛肉膏－蛋白胨液體培養(yǎng)基(NB)用于芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng);病原菌真菌培養(yǎng)基(PDA)用于植物病原真菌的培養(yǎng)與保存;高氏一號(hào)培養(yǎng)基用于微生物區(qū)系分析。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 9株芽孢桿菌抗菌譜的測(cè)定［12］采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在PDA平板中央接入培養(yǎng)18 h的拮抗芽孢桿菌菌碟(φ=5 mm)，距拮抗細(xì)菌四周2 cm處接種培養(yǎng)3～5 d的植物病原真菌菌碟(φ=5 mm)，以平板中央不接種拮抗細(xì)菌為對(duì)照，28℃ 培養(yǎng)，待對(duì)照長(zhǎng)滿平板時(shí)，測(cè)量抑菌帶寬及拮抗細(xì)菌菌落半徑，計(jì)算抑制率。抑制率(%)=抑菌帶寬/拮抗細(xì)菌菌落半徑×100。

1.2.2 9株芽孢桿菌發(fā)酵液拮抗能力的測(cè)定［13］將NA斜面培養(yǎng)基上活化18 h左右的芽孢桿菌接入NB液體培養(yǎng)基，37℃ 200 r/min發(fā)酵72 h后，4℃15000 r/min離心30 min，收集上清液，并經(jīng)細(xì)菌濾器(孔徑0.22 μm)過(guò)濾，即得無(wú)菌發(fā)酵液。采用瓊脂塊培養(yǎng)法，將芽孢桿菌發(fā)酵液傾入冷卻45℃ 左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒平板，待冷凝后，在平板上接種病原菌碟，以不加無(wú)菌發(fā)酵液的PDA平板為對(duì)照，28℃ 培養(yǎng)5 d，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿平皿2/3時(shí)，用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑 －原菌碟直徑)×100。

1.2.3小白菜生物量的測(cè)定［14］采用菌懸液澆灌土壤接種法，將小白菜的種子用無(wú)菌水浸種24 h后，播種于裝有田間土的盆缽中，10個(gè)處理，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，常規(guī)方法育苗，待真葉長(zhǎng)出后，將9株芽孢桿菌的菌懸液(×108cfu/mL)分別澆灌于各植株根部土壤，以清水為空白對(duì)照。接種后，定期測(cè)定地上部分和地下部分鮮重和干重。

1.2.4土壤中養(yǎng)分的測(cè)定［15］采集1.2.3中10種處理播種前、種植中期及收獲后的鮮、干土樣，測(cè)定土壤養(yǎng)分狀況。土壤pH用DELTA320pH計(jì)測(cè)定;有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法;全氮用凱氏定氮法;速效氮用靛酚藍(lán)比色法;全磷和全鉀用NaOH熔融—火焰光度計(jì)法;速效磷用鉬銻抗比色法，速效鉀用NH4OAc浸提—火焰光度計(jì)法測(cè)定。

1.2.5土壤中微生物類群的測(cè)定［16］采用平板菌落計(jì)數(shù)法，真菌稀釋至 10－1、10－2、10－3涂平板，28℃培養(yǎng) 5 d;細(xì)菌稀釋至 10－4、10－5、10－6涂平板，37℃ 培養(yǎng)24 h;放線菌稀釋至10－3、10－4、10－5涂平板，28℃ 培養(yǎng)7 d;芽孢菌數(shù)的測(cè)定是將細(xì)菌稀釋度為 10－3、10－4、10－5的試管 80 ℃水浴 30 min后涂平板，37℃ 培養(yǎng)24 h。

1.2.6 9株芽孢桿菌室內(nèi)相容性試驗(yàn)［17］將9株芽孢桿菌在NA斜面上活化后，制成菌懸液(約108cfu/mL)，分別加入無(wú)菌的濾紙片(φ=5 mm)浸泡10 min。取0.1 mL B01菌懸液于新鮮 NA平板上均勻涂布10 min后，將蘸有另外8株芽孢桿菌菌懸液的濾紙片貼在平皿上，28℃ 恒溫培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈的形成情況。用同樣方法驗(yàn)證菌株 B02及其他菌株之間的相容性。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003和SASS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 9株芽孢桿菌抗菌譜的測(cè)定

通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法，對(duì)9株芽孢桿菌的抗菌譜進(jìn)行了測(cè)定。由表1和表2可以看出，除菌株B09外，其余8株芽孢桿菌對(duì)植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。菌株B06和B07抗菌譜最廣、拮抗活性最高，對(duì)8種病原菌都有抑制作用，B06對(duì)7種病原菌的抑菌帶寬都大于4 mm，對(duì)4株病原菌的R2/R1≥1;B07次之，對(duì)4種病原菌的抑菌帶寬都大于4 mm，對(duì)3株病原菌的 R2/R1≥1。B01、B02、B03和B04分別僅對(duì)2種或4種病原菌的抑菌帶寬大于4 mm，其中僅3株都對(duì)2種病原菌R2/R1≧1;菌株B05僅對(duì)2種病原菌有較弱的抑制作用。菌株B08抗菌譜也較廣，但抑制作用較弱。

表1 9株芽孢桿菌菌體對(duì)8種植物病原菌的抑制能力Table 1 Antagonistic capabilities of the 9 bacillus strains to 8 pathogens

表2 9株芽孢桿菌對(duì)8種植物病原菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of the 9 bacillus strains against 8 pathogens

2.2 9株芽孢桿菌發(fā)酵液拮抗活性的測(cè)定

通過(guò)瓊脂塊法，進(jìn)行了9株芽孢桿菌發(fā)酵液拮抗活性的測(cè)定。由表3可以看出，菌株B02、B04、B06和B07發(fā)酵液的抗菌譜最廣，對(duì)8株植物病原菌都有抑制作用。其中B06和B07的抑菌活性最好。B06對(duì)8株病原菌的抑制率為66.7% ～87.5%;B07對(duì)8株病原菌的抑制率為55.6% ～81.3%;B02次之，對(duì)8株病原菌的抑制率為32.3% ～64.9%。菌株B01、B03、B05和B08分別都對(duì)7種病原菌有抑制作用，B09僅對(duì)5種病原菌有抑制作用，抑制率范圍為2.8% ～51.4%。綜合抗菌譜和發(fā)酵液拮抗活力的測(cè)定結(jié)果，得出菌株B06的拮抗活性最高，B07次之。

表3 9株芽孢桿菌無(wú)菌濾液對(duì)8種病原真菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Inhibitory rates of the 9 bacillus sterile fermentation filtrates against 8 pathogens fungi

2.3 9株芽孢桿菌菌懸液處理對(duì)小白菜生長(zhǎng)的影響

播種前盆栽土壤的基本養(yǎng)分狀況:pH 7.3左右、有機(jī)質(zhì)含量38.15 g/kg、全氮1.79 g/kg、速效氮481.28 mg/kg、全磷1.27 g/kg、速效磷304.06 mg/kg、全鉀12.48 g/kg、速效鉀363.9 mg/kg。

采用菌懸液澆灌土壤法，對(duì)不同時(shí)期小白菜植株的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行了測(cè)定，表4結(jié)果顯示，30 d時(shí)，B03和B04菌懸液處理的小白菜苗和根的干重與對(duì)照差異顯著，具有促生作用，苗干重比對(duì)照分別增長(zhǎng)了36.4%、27.3%。其余各菌株處理與對(duì)照無(wú)顯著性差異或低于對(duì)照水平，未表現(xiàn)出促生作用。60 d時(shí)，除B02和B08外，其余各菌株菌懸液處理的小白菜苗干重和根干重與對(duì)照相比差異性顯著，表現(xiàn)出了促生作用。菌株B04、B05、B07和B09菌懸液處理的小白菜苗干重和根干重與對(duì)照相比差異顯著，苗干重比對(duì)照分別增加了44.3%、38.8%、38.2% 和36.4%，促生作用顯著。菌株B01、B03和B06促生作用相對(duì)較弱，苗干重比對(duì)照增加了7.6% ～27.4%。

表4 9株芽孢桿菌菌懸液處理30 d和60 d對(duì)白菜苗生長(zhǎng)的影響Table 4 Influence of 9 bacillus strain on the growth of cabbage in 30 days and in 60 days

2.4 9株芽孢桿菌菌懸液處理對(duì)不同時(shí)期土壤養(yǎng)分變化的影響

養(yǎng)分活化的界定:若處理組全量氮、全量磷或全量鉀的含量大于或等于對(duì)照組的水平，且處理組速效氮、速效磷或速效鉀的含量大于對(duì)照組的含量，則具有活化氮、磷或鉀的作用;反之則不具有活化氮、磷或鉀的作用［15］。

通過(guò)盆栽試驗(yàn)測(cè)定了9株芽孢桿菌菌懸液處理對(duì)不同時(shí)期土壤養(yǎng)分的活化作用，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。由表5可以看出，9株芽孢桿菌菌懸液處理30 d時(shí)，土壤中有機(jī)質(zhì)含量與對(duì)照差異顯著，比對(duì)照增加了8.1% ～52.2%。菌株 B03、B04、B05、B06和B09菌懸液處理土壤中全氮和速效氮的含量大于或等于對(duì)照水平，具有活化氮的作用，菌株B03活化氮的能力最強(qiáng)，活化率為23.2%;9株芽孢桿菌處理的全磷含量都低于對(duì)照水平，均無(wú)活化磷的作用。菌株B03、B04、B05、B07和 B09菌懸液處理的全鉀和速效鉀含量顯著高于對(duì)照水平，具有活化鉀的作用，且B05活化鉀的能力最強(qiáng)，活化率為26.8%;其次是 B07，活化率為13.5%。

由表6可以看出，9株芽孢桿菌菌懸液處理60 d時(shí)，除菌株B01外，其余各菌株處理的有機(jī)質(zhì)含量均高于對(duì)照水平，其中B03、B06、B07和 B09菌懸液處理的有機(jī)質(zhì)含量較高為38.2～38.9 g/kg。菌株B01和B06菌懸液處理的全氮和速效氮含量大于或等于對(duì)照水平，具有活化氮的作用，且 B06的活化率最高為19.5%。B01和 B09菌懸液處理的全磷和速效磷的含量高于對(duì)照水平，具有活化磷的作用，且B09活化率最高為8.4%。菌株B06菌懸液處理的全鉀和速效鉀的含量大于或等于對(duì)照水平，具有活化鉀的作用，活化率為21.4%。

表5 9株芽孢桿菌菌懸液處理30 d對(duì)土壤養(yǎng)分的影響Table 5 Influence of 30 days treatment of the 9 bacillus suspended liquid on soil nutrients

表6 9株芽孢桿菌菌懸液處理60 d對(duì)土壤養(yǎng)分的影響Table 6 Influence of 60 days treatment of the 9 bacillus suspended liquid on soil nutrients

2.5 9株芽孢桿菌對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響

通過(guò)盆栽試驗(yàn)測(cè)定了9株芽孢桿菌接種不同時(shí)期對(duì)土壤微生物類群的影響(表7)，由表7可以看出，9株芽孢桿菌菌懸液處理30 d～60 d時(shí)，土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量和種類較對(duì)照均有增加，分別是對(duì)照的6.1～11.6倍和1.2～1.6倍;真菌的數(shù)量和種類明顯呈減少的趨勢(shì)，真菌的數(shù)量比對(duì)照減少了35%～75%。以上結(jié)果表明，9株芽孢桿菌菌懸液接入土壤后，使土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量增加，土壤中真菌數(shù)量減少，減少了病害發(fā)生，有利于土壤中微生物菌群的改善，朝平衡的方向發(fā)展［18］。

表7 接種9株芽孢桿菌30 d和60 d后小白菜根區(qū)土壤微生物的數(shù)量Table 7 Microbial quantities in the places of cabbage＇s rhizosphere after inoculated the 9 bacillus strains at the 30 and 60 days

2.6 室內(nèi)相容性試驗(yàn)

9株芽孢桿菌的室內(nèi)相容性試驗(yàn)結(jié)果為:B06、B08、B09拮抗B01;所有菌株與 B02無(wú)拮抗作用;B04、B05、B06、B07、B08、B09 拮抗 B03;B02、B03、B05拮抗 B04;B04、B06、B08拮抗 B05;B03、B05拮抗 B06;B05、B09拮抗 B07;B05拮抗 B08;B04、B06、B07拮抗 B09。由以上結(jié)果可以得出9株芽孢桿菌相容的組合有:B01－B02－B03;B01－B02－B05;B01－B02－B07;B01－B04－B07;B04－B06－B07－B08;B02－B06－B07－B08;B02－B05－B09;B02－B08－B09。綜合2.1～2.5的試驗(yàn)結(jié)果，可以得出最優(yōu)復(fù)配組合為 B01－B04－B07和B04－B06－B07。

3 討論與結(jié)論

在植物病害生防細(xì)菌中，芽孢桿菌是最易從土壤和植株中分離得到，并對(duì)多種土傳真菌病害具有較好防病作用的一類重要細(xì)菌。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，芽孢桿菌在防病的穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性等方面表現(xiàn)出非芽孢細(xì)菌所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)。因此，生防芽孢細(xì)菌的篩選對(duì)農(nóng)業(yè)生物防治極其重要。本研究結(jié)果表明，9株芽孢桿菌 B01～B09的菌體和無(wú)菌代謝液對(duì)8種植物真菌病害有不同程度的抑制作用。菌株B06和B07對(duì)植物病原真菌的拮抗作用具有廣譜性和高效性。在PDA培養(yǎng)基上，菌株代謝液與培養(yǎng)基1∶4混合倒平板，菌株B06和B07對(duì)病原真菌腐皮鐮刀菌、甜瓜蔓枯病菌和甜瓜根腐病菌均具有較好的抑制作用，抑制率分別達(dá)到 75.3%、87.5%和78.6%。

許多根際防病芽孢桿菌對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，它們或者本身具有解磷、固氮解鉀等特殊生理功能，可以將物質(zhì)轉(zhuǎn)化為植物所需的營(yíng)養(yǎng)成分［19］;或者產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)刺激調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng);或者通過(guò)刺激土壤中某些生理功能微生物的繁殖，加強(qiáng)土壤肥力，間接為寄主植物的生長(zhǎng)提供更多養(yǎng)分，使植物處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)［20］。小白菜盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，供試的9株芽孢桿菌的大部分菌株對(duì)小白菜的生長(zhǎng)具有不同程度的促進(jìn)作用。菌株 B03和B04的促生作用較強(qiáng)，菌懸液處理后能顯著增加小白菜生物量，且處理后小白菜根系較對(duì)照健壯，能促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，對(duì)作物有增產(chǎn)作用。此外，這些芽孢桿菌還具有活化氮、磷和鉀的作用。初步可以認(rèn)為供試芽孢桿菌對(duì)小白菜植株的促生作用是由于菌株自身具有解磷、解鉀和固氮等特殊生理功能將物質(zhì)轉(zhuǎn)化為植物所需養(yǎng)分而導(dǎo)致的。

土壤中的微生物繁殖快、數(shù)量大、代謝能力強(qiáng)是生態(tài)系統(tǒng)中碳、氮、磷、鉀等元素的轉(zhuǎn)化因子和重要庫(kù)源，對(duì)平衡生態(tài)系統(tǒng)有著極其重要的意義。微生物區(qū)系結(jié)果分析表明，不同芽孢桿菌處理后，土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量和種類有所增加，真菌的數(shù)量和種類有所減少，說(shuō)明外源接入特定細(xì)菌制劑對(duì)植株根域細(xì)菌和真菌數(shù)量會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。細(xì)菌在微生物3大類群中數(shù)量最多、比例最大，決定著植物根域微生態(tài)環(huán)境的菌群平衡和物質(zhì)能量的轉(zhuǎn)化速度。因此，植株根域細(xì)菌數(shù)量的增加，真菌數(shù)量的減少，可促使植株根域土壤由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)變，并減少了真菌性病害的發(fā)生。拮抗細(xì)菌和放線菌數(shù)量的增加，可對(duì)真菌性土傳病害形成防御屏障，促使植株根域微生物菌群朝有利的方向發(fā)展［21］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物肥料的研究不斷深入，微生物的種類也更加多元化，但對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行多元化的篩選及將具有不同功效的芽孢桿菌進(jìn)行組合得到全效型和功能型的芽孢菌株或其組合仍然是生物肥料研制中的不足，同時(shí)又是一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究從抑病、促生、養(yǎng)分活化和改善微生物區(qū)系四個(gè)方面，篩選出了7株具有一種或多種功能的芽孢桿菌，并得到功能組合B04－B06－B07和B01－B04－B07，使微生物菌群在組成和功能上逐漸由單一走向多元化成為可能，為復(fù)合生物肥料的研發(fā)和生產(chǎn)提供了理論指導(dǎo)，對(duì)生物農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展具有重大意義。

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