Ag-NORs 與人頭發(fā)毛囊細胞活性的研究

唐 文，吳安花，向玲麗，葉合生，胡琦，楊粵軍

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

1975年，Goodpasture和Howell 等應(yīng)用銀氨法特異地染色核仁形成區(qū)，證實銀染的位置是染色體上核糖體基因(rDNA）的位置。此后進一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，也不是rRNA，而可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA 轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白（Ag-NORs）是一種酸性非組蛋白C23，在rDNA 轉(zhuǎn)錄活性中起重要調(diào)控作用。核仁組成區(qū)銀染強度反映了rDNA 轉(zhuǎn)錄活性水平，與細胞增殖活性密切相關(guān)[1],已被不少學(xué)者用于腫瘤的分級和癌前病變的診斷檢測,對于良惡性病變的鑒別診斷價值很大[2]，有人用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白這個技術(shù)對比檢測良、惡性骨腫瘤細胞進行檢測[3]，也有實驗室用此技術(shù)測量眼組織的活性[4]；還有醫(yī)生以核仁形成區(qū)銀染蛋白的指標評價腫瘤患者免疫狀況[5]。我們的實驗是采用不同人群的毛囊細胞，用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白檢測活性，找到他們之間的差異。為進一步研究毛囊細胞活性與毛發(fā)的生長的關(guān)系提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標本選擇

年輕男女，小孩，老年男女各50人帶毛囊細胞的毛發(fā)。

1.2 染色液的制備

2%的白明膠液：取2g 明膠溶于1%甲酸水溶液100mL中混勻。50%硝酸銀水溶液。

1.3 方法

用鑷子取毛囊細胞的頭發(fā)2～3 根置載玻片中央，加2～3 滴40%醋酸液，室溫放置10 分鐘左右，使毛囊軟化，用刀片刮下毛囊細胞，棄去頭發(fā)，用刀尖或針尖將毛囊細胞分散并均勻涂于載玻片中央，在酒精燈上遠火干燥；加2～3 滴固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），固定15 分鐘，自然干燥；加5N 鹽酸2～3滴，靜置10 分鐘；用蒸餾水沖去蓋玻片及多余染液，自然晾干；將玻片標本置入下鋪潮濕吸水紙的容器中，容器放入37℃水浴箱；在標本上加染色液2 滴，用洗耳球吹勻，蓋下水浴箱蓋，37℃15 分鐘（此步一定要避光）。

取出標本用蒸餾水充分沖洗，干燥后，即可鏡檢觀察。觀察分析：在顯微鏡下可見間期核和中期分裂相的染色體被染成黃色，核仁被染成黑色，某些染色體上有銀染黑點，即核仁形成區(qū)。AgNOR 計數(shù) 按Crocker 推薦方法[6]油鏡下隨機數(shù)1100 個毛囊細胞，計數(shù)每個細胞核內(nèi)AgNOR 顆粒數(shù)，求出平均值。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，不同年齡，不同性別，以及頭發(fā)的黑白不同AgNORs 顆粒數(shù)量不同，而且分布也不相同。通過大量實驗大量圖片的比較發(fā)現(xiàn)，黑發(fā)毛囊細胞中核仁銀染著色比白發(fā)毛囊細胞中核仁銀染顏色要深；而部分老年白發(fā)毛囊細胞中可無銀染核仁；成人毛囊細胞中核仁體積較小孩毛囊細胞中核仁體積小。

AgNOR 顆粒計數(shù)：男性組每個細胞核內(nèi)通常只見1～2 個圓形的黑色銀染小顆粒，可見3 個，平均1.28±0.47。女性組細胞核內(nèi)銀染顆粒數(shù)目較多，常為2 個，可見3～4 個，平均1.88±0.33。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理每個細胞核內(nèi)AgNOR 顆粒平均數(shù)在男女老少及白發(fā)與黑發(fā)之間，見圖1。統(tǒng)計的毛囊細胞銀染核仁數(shù)見表1。

3 討論

Howell 認為NOR的銀可染性反映了rRNA 基因的活性。只有有轉(zhuǎn)錄活性或已經(jīng)轉(zhuǎn)錄過的，并且其上仍有殘余的與RNA 相聯(lián)系的蛋白質(zhì)的核仁形成區(qū)才能被銀染色。沒有銀染粒的NOR 可能意味著rDNA 順反子不轉(zhuǎn)錄rRNA，即這些位點沒有與rRNA 相聯(lián)系的銀可染的蛋白質(zhì)。銀染法是目前表征rDNA 基因功能的一個準確的方法。人類核糖體RNA 基因位于5 對近端著絲點染色體短臂的次縊痕處，即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-10 個。應(yīng)用銀染法可以覺察正常人體核糖體RNA 基因的活動。因此，應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）技術(shù)，可以分析有活性的rRNA 基因的動態(tài)變化。

圖1 發(fā)毛囊細胞核中AgNOR 顆粒

表1 不同人群毛囊細胞活性統(tǒng)計表

本文觀察到，老年白發(fā)毛囊細胞的活性最低，年輕男女的毛囊細胞活性最強，年輕男女之間活性差別不大。各個不同人群毛囊細胞活性比較分別是：年輕女黑發(fā)＞年輕男黑發(fā)＞年輕男白發(fā)＞老年黑發(fā)＞年輕女白發(fā)＞小孩黑發(fā)＞老年白發(fā)。

Ag-NORs 是位于某些染色體上特殊部位的核糖體基因rDNA，通過其轉(zhuǎn)錄而形成核糖體RNA，在蛋白質(zhì)合成中起極其重要的作用。研究表明，Ag-NORs 可能就是調(diào)節(jié)rDNA 轉(zhuǎn)錄的聚合酶Ⅰ的亞單位，起保持rDNA 鏈伸展的作用，對核糖體的形成及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要，可作為rDNA轉(zhuǎn)錄活性的標志及蛋白質(zhì)合成的活躍狀態(tài)，來反映核仁結(jié)構(gòu)和功能的變化[7]。Ag-NORs 數(shù)目與細胞動力學(xué)、染色體核型中帶有NORs 數(shù)目及細胞周期有著密切的關(guān)系[8]。

毛囊細胞是決定頭發(fā)生長、濃密程度的關(guān)鍵。普通人的毛發(fā)每28～30天為一個更新周期，受外環(huán)境及年齡等因素的影響，毛囊非常容易壞死萎縮，導(dǎo)致嚴重的脫發(fā)問題。科學(xué)家經(jīng)過多年的研究，發(fā)現(xiàn)只要再次激活萎縮受損的毛囊，頭發(fā)就能得到重生。而我們用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白（Ag-NORs），測量男女老少之間、白發(fā)與黑發(fā)之間的毛囊細胞活性，發(fā)現(xiàn)不同人群之間毛囊細胞活性的變化，為進一步研究毛發(fā)的生長提供基礎(chǔ)。

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