象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)近海沉積物細(xì)菌群落的影響

裘瓊芬 ，張德民，葉仙森，鄭珍珍

(1．寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211;2．國家海洋局寧波海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，寧波 315012)

隨著世界人口的增長和捕撈漁業(yè)的日漸枯竭，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，已成為人類蛋白質(zhì)的重要來源之一。網(wǎng)箱養(yǎng)殖作為一種高度集約化的養(yǎng)殖模式，具有高產(chǎn)、高效益等特點(diǎn)［1］。但與此同時(shí)，大量養(yǎng)殖廢物的輸出，使海洋食物鏈和生態(tài)系統(tǒng)遭到了直接或間接的影響［1-2］。近海是養(yǎng)殖活動(dòng)的集中地帶，海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖對(duì)環(huán)境中碳、氮、磷、懸浮顆粒、硫化物和營養(yǎng)鹽等產(chǎn)生了顯著影響［3］。海水魚類養(yǎng)殖餌料中估計(jì)有23%的碳，21%的氮和53%的磷會(huì)在養(yǎng)殖環(huán)境底部沉積物中積累，對(duì)1 km以內(nèi)的環(huán)境都會(huì)有顯著影響［4］。Yoza等通過對(duì)夏威夷歐胡島養(yǎng)殖區(qū)域沉積物的分析表明，養(yǎng)殖區(qū)域有機(jī)碳含量比非養(yǎng)殖區(qū)高25%—37%，氨含量比非養(yǎng)殖區(qū)高30%—46%［5］。此外，有機(jī)物質(zhì)的富集，大大增加了耗氧量［4］，是近海富營養(yǎng)化和氧氣缺失的源頭之一［6-7］;同時(shí)，因養(yǎng)殖活動(dòng)引入的抗生素類物質(zhì)［8-9］，已成為水生動(dòng)物甚至人類健康的重要問題。

微生物的多樣性是正確評(píng)價(jià)海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的主要組成部分。養(yǎng)殖活動(dòng)影響了沉積物中微生物多樣性，影響了微生物群落的組成和分布，進(jìn)而擾亂了微生物的生態(tài)功能［10］。Caruso等發(fā)現(xiàn)地中海區(qū)域的漁場(chǎng)在存在前后，水體中異養(yǎng)細(xì)菌的密度變化不大，而沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌的密度則顯著增加［11］，表明養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)近海環(huán)境中微生物的分布存在顯著影響。養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)海洋環(huán)境中微生物群落的改變反過來對(duì)人類的健康又會(huì)有決定性的影響(比如:病原菌的傳播和抗生素的耐抗)。因此，詳細(xì)分析微生物多樣性是研究人類活動(dòng)對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)影響必不可少的一部分［2］。

關(guān)于養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)沉積物細(xì)菌多樣性影響的研究還較少，以往沉積物中微生物多樣性的研究也多是基于培養(yǎng)技術(shù)［12-14］。但已有的研究表明，分離培養(yǎng)等傳統(tǒng)的微生物研究方法只能得到環(huán)境中不到1%的微生物［15-16］，因此以往對(duì)沉積物中微生物的純培養(yǎng)分析不能真實(shí)地反映其中的微生物群落結(jié)構(gòu)，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)沉積物中微生物多樣性的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生偏差，影響對(duì)近海生態(tài)系統(tǒng)的正確評(píng)價(jià)。近年來，基于16S tag分析的454(Roche)焦磷酸測(cè)序技術(shù)的一個(gè)反應(yīng)可以得40萬到100萬條序列，包含了足夠的信息用于微生物的分類［17］。這種方法的使用在人類微生物群組和環(huán)境微生物群落方面都得到了很多新的結(jié)果［18-19］，但成本還較昂貴。T-RFLP技術(shù)是將RFLP技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合后發(fā)展的一種較先進(jìn)的分子生態(tài)學(xué)方法，是檢測(cè)操作分類單元(OTUs)的高通量方法，可用于大量樣品的檢測(cè)，并得到數(shù)據(jù)化的結(jié)果，Liu等［20］于1997年將其首次應(yīng)用于微生物群落多樣性的研究。該方法靈敏度較高，適于微生物群落多樣性中等或更低環(huán)境樣品的多樣性分析，是目前大量環(huán)境樣品微生物生態(tài)分析的主要手段［21］。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1．1 樣品采集

沉積物樣品于2011年7月取自浙江省寧波市象山港內(nèi)3個(gè)不同區(qū)域(圖1):象山港口非養(yǎng)殖區(qū)(CK:29°36'11．94″N，121°46'18．00″E)、西滬港口交匯區(qū)(IS:29°33'0．66″N，121°44'10．86″E)和西滬港內(nèi)網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)(AC:29°32'33．66″N，121°46'6．42″E)。同期，國家海洋局寧波海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站測(cè)定了3個(gè)區(qū)域表層沉積物的總有機(jī)碳(TOC)含量、上層水的TOC和鹽度(表1)。每個(gè)區(qū)域布置3個(gè)平行位點(diǎn)，用底泥采樣器在各位點(diǎn)采集深度大于70 cm的柱狀沉積物，粒徑分析表明均為粉砂質(zhì)粘土(表1)。將沉積物在原位按深度切割分成6層:0—5，5—10，10—15，15—20，20—25，50—55 cm。所有沉積物樣品立即用液氮冰凍，帶回實(shí)驗(yàn)室存于-20℃。

表1 樣品采集區(qū)域的理化背景Table 1 Physicochemical background of the sediments in sampling sites

1．2 理化分析

采樣現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定沉積物的氧化還原電位(Eh)和溫度。氧化還原電位的測(cè)定采用帶甘汞-鉑電極的PHB-4便攜式酸度計(jì)(上海精科)，并根據(jù)pH值通過公式Eh=Eh'+(pH-7)×60對(duì)實(shí)測(cè)值Eh'進(jìn)行校正。去離子水浸提沉積物，用pH計(jì)(上海精科)測(cè)得上清液的pH值。硫酸鹽濃度測(cè)定按照HJ/T342—2007標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。

圖1 采樣位點(diǎn)示意圖Fig．1 Sampling sites

1．3 沉積物總DNA的提取

總DNA的提取采用MP公司的土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN kit for soil)，稱取混勻的沉積物核心樣品各0．5 g按照說明書進(jìn)行操作，最后將總DNA溶于100 μL DES(試劑盒提供)中。

1．4 細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增

采用帶FAM熒光標(biāo)記的細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F-FAM(5'-FAM-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')和907R:(5'-CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT-3')，取1 μL總DNA作為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系(50 μL):5 μL 10×Buffer，4 μL 2．5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，1 μL 2．5 U Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)，1 μL模板DNA，加滅菌ddH2O至50 μL并混勻。擴(kuò)增條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性后，用DNA純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化。

1．5 細(xì)菌16S rRNA基因的限制性酶切

采用限制性內(nèi)切酶Msp I(TaKaRa公司)對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系(40 μL):4 μL 10× Buffer，4 μL 0．1%BSA，10U 限制性內(nèi)切酶，30 μL PCR 純化產(chǎn)物，加滅菌 ddH2O 至 40 μL 并混勻。37℃酶切3 h后，立即加入3×40 μL的預(yù)冷無水乙醇和0．1×40 μL的3mol/L NaAc(pH值5．2)，采用乙醇沉淀法純化脫鹽，純化后溶于10 μL滅菌ddH2O。

1．6 限制性片段的基因掃描

取1—3 μL酶切純化得到的樣品，與10 μL HiDi-甲酰胺和0．2 μL內(nèi)標(biāo)(MapMarker 1000)混勻后在95℃變性3 min，馬上置于冰浴，然后通過ABI 3130 Genetic Analyzer進(jìn)行限制性片段的基因掃描，并由 ABI GeneMap分析軟件獲取T-RFLP結(jié)果。

1．7 克隆/測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建CK區(qū)域0—5 cm沉積物樣品的細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫。擴(kuò)增引物采用無FAM熒光標(biāo)記的引物27F/907R，其余PCR條件同上。以凝膠純化后的PCR產(chǎn)物為模板，pMD19-T Vector(TaKaRa公司)為載體，在16℃連接反應(yīng)3 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)，并涂布于含X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上。分別篩選93個(gè)細(xì)菌陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，所得序列利用ARB軟件［25］中的NJ算法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。所有序列已提交EMBL，序列號(hào)為HE648378-HE648470。

1．8 數(shù)據(jù)處理

以細(xì)菌16S rRNA基因T-RFLP圖譜中每一個(gè)限制性片段(T-RF)為1個(gè)可操作分類單元(OTU)，以T-RF相對(duì)峰高值(每個(gè)T-RF的峰高占累計(jì)峰高的比值)作為各OUT的相對(duì)豐度，相對(duì)豐度低于0．5%的OTU不予考慮。根據(jù)OTU的數(shù)目(S)及其相對(duì)豐度(Pi)進(jìn)行多樣性分析，包括計(jì)算Shannnon-Weiner多樣性指數(shù)(H'=-∑ Pi lnPi)和Pilou的均勻度指數(shù)(E'=H/lnS)。

2 結(jié)果與分析

2．1 沉積物理化性質(zhì)

象山港不同區(qū)域的沉積物溫度相似，且具有相同的變化趨勢(shì)(表2):表層沉積物的溫度均為26．5℃，隨著深度的增加，溫度逐漸降低。pH值測(cè)量結(jié)果顯示，沉積物均呈微堿性(圖2)，pH值處于7．6—7．9之間，且CK與IS區(qū)域沉積物相似，但AC區(qū)域不同深度沉積物pH值明顯高于其它兩個(gè)區(qū)域。與pH值不同，AC區(qū)域各深度沉積物的Eh介于CK和IS區(qū)域，且隨深度呈下降趨勢(shì)(圖2)。CK區(qū)域不同深度沉積物的Eh變化不明顯，均處于190 mV左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于IS區(qū)域(100 mV左右)。硫酸鹽含量在養(yǎng)殖區(qū)和交匯區(qū)沉積物中隨著深度的變化無明顯規(guī)律(圖2)，但在對(duì)照區(qū)呈現(xiàn)隨深度降低的趨勢(shì)。尤其在50—55 cm沉積物中，硫酸鹽含量顯著降低，低于768×10-6。平均來說，AC區(qū)域的較高，不同深度沉積物的均值為1200×10-6，CK區(qū)域則只有 950×10-6。

表2 各區(qū)域不同深度沉積物溫度(Mean±SE，n=3)Table 2 Temperature of the different deep sediments in each site(Mean± SE，n=3)

圖2 各區(qū)域不同深度沉積物的pH、Eh和硫酸鹽含量(Mean±SE，n=3)Fig．2 pH，Eh andcontents of the different deep sediments in each site(Mean±SE，n=3)

2．2 基于T-RFLP的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物27F/907R擴(kuò)增沉積物總DNA，進(jìn)行末端限制性片段長度多態(tài)性分析，得到細(xì)菌群落的T-RFLP圖譜(圖3)。由圖3可以看出，所有沉積物中細(xì)菌種類較豐富，末端限制性片段(T-RFs)的長度主要集中在100—200 bp和510—520 bp左右。相比于同一區(qū)域、不同深度沉積物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，不同區(qū)域之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異更加顯著。比較3個(gè)區(qū)域不難發(fā)現(xiàn)，CK區(qū)細(xì)菌T-RFs明顯多于AC區(qū)，且以T-RF長度處于165 bp和520 bp左右的相對(duì)豐度最高。在IS區(qū)域，則是T-RF 230 bp和520 bp占主要地位。AC區(qū)域中，不同平行位點(diǎn)間細(xì)菌群落的差異較大，尤其是表層0—5 cm、20—25 cm和50—55 cm。但T-RF 520 bp所代表的細(xì)菌在不同深度的沉積物中還是占有較高的相對(duì)豐度。

2．3 細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育分析

由細(xì)菌16S rRNA基因的克隆文庫和系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)可知，沉積物中細(xì)菌的多樣性豐富，主要包括變形細(xì)菌綱(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、熱微菌門(Thermomicrobia)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、酸桿菌門(Acidobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)浮霉菌門(Planctomycetes)以及OP11等。對(duì)所得序列進(jìn)行in silico酶切分析可知，T-RF 165 bp可能屬于變形細(xì)菌(Proteobacteria)或厚壁菌門(Firmicutes)的細(xì)菌，但克隆文庫中只有4個(gè)克隆屬于厚壁菌門(Firmicutes)，因此推測(cè)T-RF 165 bp主要屬于變形細(xì)菌綱(Proteobacteria);而T-RF 510—520 bp所代表的細(xì)菌則主要分布在熱微菌門(Thermomicrobia)。由此可見，熱微菌門(Thermomicrobia)的細(xì)菌在所有沉積物中均有一定的豐度，在細(xì)菌克隆文庫中也占了19．4%;而變形細(xì)菌(Proteobacteria)則在未受養(yǎng)殖活動(dòng)影響的CK區(qū)域中有較高的相對(duì)豐度，在CK區(qū)域0—5 cm沉積物樣品的細(xì)菌克隆文庫中占23．7%。

2．4 細(xì)菌群落多樣性分析

基于細(xì)菌16S rRNA基因T-RFLP圖譜中末端限制性片段的數(shù)目及其相對(duì)豐度，計(jì)算了各區(qū)域不同深度沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)H'和均勻度指數(shù)E'(表3)。由表3可知，在AC區(qū)域，除表層0—5 cm外，細(xì)菌的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均隨著深度的增加而降低。與對(duì)照區(qū)CK相比，AC區(qū)域細(xì)菌的多樣性顯著降低。與AC不同，CK區(qū)域具有較一致的均勻度指數(shù)，細(xì)菌群落在不同深度的沉積物中具有相似物種豐富度。IS區(qū)域的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)則介于CK和AC區(qū)域之間。因此，從細(xì)菌的多樣性來說，CK＞IS＞AC。

圖3 沉積物中細(xì)菌群落的T-RFLP圖譜Fig．3 T-RFLP profiles of bacterial communities of sediments

表3 基于T-RFLP圖譜的細(xì)菌多樣性分析(Mean±SE，n=2或3)Table 3 Analysis of bacterial diversity based on T-RFLP profiles(mean± SE，n=2 or 3)

3 討論與結(jié)論

圖4 細(xì)菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig．4 Phylogenetic relationship(neighbor-joining)of bacterial 16S rRNA gene sequences

微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能受環(huán)境因素的制約［26］，沉積物中微生物的多樣性與養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)近海環(huán)境的影響密切相關(guān)。一直以來，溫度被認(rèn)為是微生物群落最重要的影響因子之一［27-28］。本研究的結(jié)果也顯示，隨著深度的增加，沉積物溫度降低(表2)，細(xì)菌群落的多樣性呈降低趨勢(shì)(表3)。另外，許多研究表明，pH值對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生顯著影響［29-30］。網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物的pH值較對(duì)照區(qū)及交匯區(qū)高(圖2)，對(duì)養(yǎng)殖區(qū)微生物多樣性的降低。養(yǎng)殖活動(dòng)還給近海環(huán)境帶入了大量的還原性有機(jī)物［31］，耗氧率也會(huì)比對(duì)照區(qū)高2—5倍［4］。因此，本研究中養(yǎng)殖區(qū)沉積物的氧化還原電位與對(duì)照區(qū)相比也降低了。氧化還原電位的降低使沉積物環(huán)境逐漸呈現(xiàn)缺氧狀態(tài)，影響需氧微生物的代謝活動(dòng)，不利于有機(jī)質(zhì)的好氧分解，進(jìn)而影響?zhàn)B殖環(huán)境與養(yǎng)殖生物的健康。氧化還原電位和pH值與其它營養(yǎng)鹽類的分布存在一定關(guān)系［32］。本研究中沉積物硫酸鹽的濃度變化(圖2C)與氧化還原電位的變化無很好的相關(guān)性，說明存在影響沉積物氧化還原電位的其它因素，硫酸鹽并非主導(dǎo)因素。因此，沉積物的溫度、pH值和氧化還原電位都會(huì)影響其中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性［13，29］。

多樣性指數(shù)是評(píng)價(jià)微生物群落多樣性的有效方法，它包括微生物種類的豐富度及種類的均勻度［33］。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析表明，網(wǎng)箱養(yǎng)殖降低了象山港近海沉積物中細(xì)菌群落的多樣性(表3)。在未受養(yǎng)殖活動(dòng)影響的對(duì)照區(qū)沉積物中，細(xì)菌群落多樣性豐富，多樣性指數(shù)H'＞3．5，且具有良好的均勻度(0．93)。受養(yǎng)殖活動(dòng)影響后，沉積物中微生物的多樣性指數(shù)下降，且不同深度沉積物中細(xì)菌的均勻度也不再一致。近海的網(wǎng)箱養(yǎng)殖不但降低了沉積物中細(xì)菌的多樣性，而且細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。在對(duì)照區(qū)，變形細(xì)菌(Proteobacteria)和熱微菌門(Thermomicrobia)的細(xì)菌是其中的優(yōu)勢(shì)菌群(圖3，圖4)，但在養(yǎng)殖區(qū)，變形細(xì)菌(Proteobacteria)豐度明顯減少，且因養(yǎng)殖活動(dòng)中不同時(shí)期引入不同數(shù)量和成分的有機(jī)物，有機(jī)物在不同位置和不同深度的分布都可能存在一定差異，使得不同深度、不同平行位點(diǎn)間細(xì)菌群落的差異較大(圖3)。在交匯區(qū)，養(yǎng)殖海水受到外界海水的稀釋，其中由養(yǎng)殖活動(dòng)帶入的物質(zhì)濃度降低，沉積物受養(yǎng)殖活動(dòng)的影響也降低，使微生物的多樣性處于對(duì)照區(qū)與養(yǎng)殖區(qū)之間(表3)。劉晶晶等［14］采用分離培養(yǎng)的方法對(duì)象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)細(xì)菌群落的研究中也發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)細(xì)菌群落的多樣性要低于對(duì)照點(diǎn)，且某些與魚類疾病相關(guān)的假單胞菌、弧菌等特定細(xì)菌類群富集。由此可見，近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖使沉積物中的細(xì)菌群落由多樣性較高的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)向多樣性降低的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使養(yǎng)殖環(huán)境處于相對(duì)脆弱狀態(tài)，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害爆發(fā)幾率增加。

此外，養(yǎng)殖區(qū)表層0—5 cm沉積物中細(xì)菌的多樣性低于5—10 cm的沉積物，這與Bore等［34］對(duì)潮間帶沉積物中細(xì)菌的多樣性研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)10—15 cm沉積物中細(xì)菌的可操作分類單元(OUT)數(shù)高于表層0—10 cm的樣品。推測(cè)其原因可能是表層沉積物受流動(dòng)水體的干擾最為直接，養(yǎng)殖活動(dòng)帶入的有機(jī)物等也主要聚集在沉積物表層，使表層沉積物中微生物的多樣性明顯下降。

綜上所述，本研究將T-RFLP技術(shù)和16S rRNA基因文庫的方法相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖活動(dòng)不但使象山港沉積物Eh、pH等理化性質(zhì)有所改變，而且使細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，降低了細(xì)菌群落的多樣性和均勻度。

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