酶解玉米黃粉制備降血壓肽的研究

王俊彤 鄭喜群 劉曉蘭

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

高血壓是一種以動(dòng)脈收縮或舒張壓升高為特征的臨床綜合癥，它會(huì)對(duì)大腦、心血管及腎臟造成損害［1］。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I－converting enzyme，ACE）是影響人體血壓平衡的重要因素［2］。目前，治療高血壓的藥物多為化學(xué)合成的ACE抑制劑（ACEI）。這些藥物雖然效果顯著，但長(zhǎng)期服用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生各種不良反應(yīng)，且停藥后血壓易反彈。與此相比，以動(dòng)植物為來(lái)源的降血壓肽不僅具有良好的降血壓效果，而且無(wú)毒副作用，適合各種人群服用［3］。

玉米黃粉（corn gluten meal，又稱玉米蛋白粉）是玉米濕法加工淀粉過程中的主要副產(chǎn)物之一，含有62%～71%的蛋白質(zhì)［4］。由于玉米黃粉成分復(fù)雜，口感粗糙，水溶性低，功能特性差，難以直接利用［5］。但玉米蛋白的氨基酸組成獨(dú)特，含有高比例的亮氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸，很少含有賴氨酸等堿性氨基酸，這使它成為制備多種生理活性肽，特別是降血壓多肽的良好來(lái)源［6］。風(fēng)味蛋白酶包含內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性，適用于生產(chǎn)低苦味多肽，能夠較好的改善水解物的風(fēng)味［7］。另外，它是由微生物發(fā)酵而得，價(jià)格便宜，適合工業(yè)生產(chǎn)。因此，利用風(fēng)味蛋白酶水解玉米黃粉，可以獲得ACE抑制率較高及風(fēng)味較佳的玉米肽產(chǎn)品。本研究以玉米黃粉為原料，對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解制備降血壓肽的工藝進(jìn)行初探，旨在為ACE抑制肽的分離純化及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米黃粉：蛋白質(zhì)含量56.24%，黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；

α－淀粉酶：酶活為2.85×103U／g，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶：酶活為3.37×104U／g，丹麥NovoNordisk公司；

ACE、Hip－His－Leu（HHL）：美國(guó)Sigma公司；

其他試劑：均為分析純，市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)：TCL－16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101－3－S型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

水浴恒溫振蕩器：SHZ－88型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

pH計(jì)：pB－10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

Beckman分光光度計(jì)：DU800型，美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米黃粉的預(yù)處理方法 采用擠壓膨化和去淀粉處理［8］。將玉米黃粉用雙螺桿膨化機(jī)膨化。調(diào)節(jié)玉米黃粉含水量至16%，膨化機(jī)在160～180℃，1.0～1.5MPa條件下進(jìn)行膨化。膨化后在室溫下干燥，粉碎、過60目篩。再用pH 6.0的0.02mol／L磷酸鹽緩沖將擠壓膨化后的玉米黃粉配制成濃度為10%（m／V）的懸浮液。加入α－淀粉酶（30U／g），60℃水解2h。反應(yīng)結(jié)束后酶解液在100℃滅酶30min。水解后沉淀用等量的水洗滌3次，徹底去除淀粉水解的產(chǎn)物。最后將去掉淀粉的玉米黃粉在60～70℃的烘箱中烘干，粉碎，作為蛋白酶酶解試驗(yàn)的原料。

1.2.2 風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme水解玉米黃粉的條件優(yōu)化

用磷酸鹽緩沖液將預(yù)處理的玉米黃粉配制成一定濃度的懸浮液，進(jìn)行Flavourzyme催化水解反應(yīng)，每隔一定時(shí)間取適量水解液，立即于沸水中加熱20min以鈍化酶活力，4 000r／min離心20min，測(cè)定上清液中ACE抑制率。以水解溫度、水解液pH、底物濃度和加酶量為因素進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，確定風(fēng)味蛋白酶水解玉米黃粉的最佳條件。

單因素試驗(yàn)方法：① 溫度對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率 的 影 響：在 底 物 濃 度 為 5%（m／V）， 加 酶 量 為3% （m／m），水解液pH 6.0條件下，考察溫度分別為45，50，55℃時(shí)對(duì)Flavourzyme催化水解反應(yīng)的影響；② 水解液pH對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響：在底物濃度為5% （m／V），加酶量為3% （m／m），溫度為50℃條件下，考察水解pH分別為6.0、6.5和7.0時(shí)對(duì)Flavourzyme催化水解反應(yīng)的影響；③ 底物濃度對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響：在加酶量為3% （m／m），水解液pH 6.0，溫度為50℃條件下，考察底物濃度分別為4%、5%和6%（m／V）時(shí)對(duì)Flavourzyme催化水解反應(yīng)的影響；④ 加酶量對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響：在溫度為50℃，底物濃度為5%（m／V），水解液pH 6.0條件下，考察加酶量分別為2%、3%和4%（m／m）時(shí)對(duì)Flavourzyme催化水解反應(yīng)的影響。

1.2.3 ACE抑制率的測(cè)定 參照 Cushman［9］紫外分光光度法的基本原理測(cè)定。

1.2.4 不同分子量水解產(chǎn)物的制備 選用截留分子量為10kDa和6kDa的中空纖維素膜對(duì)玉米黃水解液進(jìn)行超濾處理，將水解液分為＞10kDa，6～10kDa，＜6kDa 3個(gè)組分。超濾壓力0.1MPa，溫度為室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響

由圖1可知，隨著溫度升高，水解物ACE抑制率增加，但溫度過高時(shí)，水解物ACE抑制率反而降低，可能是由于Flavourzyme不耐高溫，高于50℃時(shí)會(huì)使其分子的次級(jí)鍵斷裂，使蛋白酶變性，酶分子的活性減弱甚至完全失活，導(dǎo)致水解物中ACE抑制肽產(chǎn)率降低。溫度為50℃時(shí)，水解物ACE抑制率最高，其次是45℃。因此選擇酶解溫度為50℃。

圖1 溫度對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響Figure 1 Effect of temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.2 pH對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響

由圖2可知，F(xiàn)lavourzyme為酸性蛋白酶，在較低的pH范圍內(nèi)，具有較強(qiáng)的酶解能力。水解反應(yīng)初期，不同pH條件下水解物ACE抑制率相當(dāng)，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)pH 6.0的水解物ACE抑制率變化較為平穩(wěn)，而其它水解反應(yīng)進(jìn)行6h時(shí)，ACE抑制率都有明顯降低，隨后又逐漸增大。其中pH 6.5、水解8h時(shí)，水解物 ACE抑制率最高，達(dá)67.46%±3.45%，因此，選擇pH 6.5為最適pH。由于水解過程復(fù)雜，水解反應(yīng)進(jìn)行中，不斷有肽鍵發(fā)生斷裂和縮合，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的ACE抑制率呈現(xiàn)波浪式變化。

圖2 pH對(duì)玉米蛋白粉水解物ACE抑制率的影響Figure 2 Effect of pH on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.3 底物濃度對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響

由圖3可知，隨著底物濃度的增加，水解物ACE抑制率呈先增大后減小的變化趨勢(shì)，適當(dāng)增加底物濃度使蛋白酶作用位點(diǎn)增多，酶與底物充分結(jié)合，ACE抑制肽含量增加。但底物濃度過高，會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，水解反應(yīng)變?nèi)?。?dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，水解物ACE抑制率最高，繼續(xù)增加底物濃度并沒提高ACE抑制率。因此，選擇底物濃度為5%。

圖3 底物濃度對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響Figure 3 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.4 加酶量對(duì)玉米黃粉水解物ACE抑制率的影響

由圖4可知，當(dāng)加酶量較低時(shí)，有足夠的底物與酶結(jié)合，水解物ACE抑制率與加酶量成正比；當(dāng)加酶量較高時(shí)，玉米黃粉的相對(duì)濃度較小，產(chǎn)物積累對(duì)酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，水解物ACE抑制率降低。當(dāng)加酶量為4%時(shí)，其水解物ACE抑制率與加酶量為3%時(shí)相比，并沒有顯著提高，且水解8h時(shí)，兩者水解物ACE抑制率相當(dāng)。綜合考慮選擇加酶量為3%。

圖4 加酶量對(duì)水解物ACE抑制率的影響Figure 4 Effect of E∶S on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討最佳水解條件，以ACE抑制率為指標(biāo)判定Flavourzyme對(duì)玉米黃粉的酶解效果，選擇水解溫度、水解液pH、加酶量和底物濃度4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)可知，酶解時(shí)間為8h的水解物ACE抑制率最大，所以確定正交試驗(yàn)水解時(shí)間定為8h。試驗(yàn)方案及方差分析見表1～3。

由表2可知，F(xiàn)lavourzyme水解玉米黃粉制備ACE抑制肽時(shí)，影響水解物ACE抑制率的因素主次順序?yàn)榧用噶浚―）＞底物濃度（C）＞pH（A）＞溫度（B）。最佳組合為A2B1C2D2，即加酶量為3.5% （m／m），底物濃度為6.0%（m／V），水解溫度為45℃，pH為6.75。由表3可知，僅加酶量對(duì)水解物ACE抑制率影響顯著。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，水解物ACE抑制率為68.16%，可溶性蛋白含量為2.59mg／mL。劉萍等［10］用風(fēng)味蛋白酶酶解玉米蛋白時(shí)，其水解產(chǎn)物ACE抑制率為31.86%。劉志國(guó)等［11］分別用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行水解，其水解產(chǎn)物ACE抑制率分別為33.13%、68.36%和45.55%。本研究中得到的水解物ACE抑制率較高。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)表Table 1 Factors and levels of orthogonal test L9（34）

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析?Table 2 Result and analysis of orthogonal test（n ＝3）

2.6 不同分子量水解產(chǎn)物的ACE抑制率

玉米黃粉水解液首先通過一個(gè)截留分子量為10kDa的超濾膜。水解液的一部分立刻被分開，再將濾液通過一個(gè)截留分子量為6kDa的超濾膜，即得到＞10kDa，6～10kDa和＜6kDa 3個(gè)分子量范圍的多肽組分，各組分分別冷凍抽干，再配制成一定濃度的蛋白溶液（2.6mg／mL）。各組分蛋白溶液的ACE抑制率見表4。由表4可知，＜6kDa組分的ACE抑制率最高，比原水解液增加約20%，且含量占總水解產(chǎn)物的40%左右。此現(xiàn)象說明風(fēng)味蛋白酶酶解玉米黃粉的水解物中的ACE抑制肽多為小分子量短肽，這與相關(guān)報(bào)道［1］相符。對(duì)水解液進(jìn)行分級(jí)分離，獲得ACE抑制率較高的多肽組分，這為進(jìn)一步分離純化奠定了基礎(chǔ)。

表3 方差分析結(jié)果?Table 3 Result of variance analysis

表4 各組分蛋白溶液的ACE抑制率Table 4 ACE inhibitory activity of each fraction／%

3 結(jié)論

以玉米黃粉為原料，經(jīng)擠壓膨化和去淀粉處理后，利用Flavourzyme酶解制備ACE抑制肽，確定最優(yōu)工藝條件為溫度45 ℃，pH 6.75，底 物 濃 度 6.0% （m／V），加 酶 量3.5%（m／m），水解時(shí)間8h。在此條件下ACE抑制率為68.16%。水解物經(jīng)超濾，被分為＞10kDa，6～10kDa和＜6kDa 3個(gè)組分，其中低分子量組分的ACE抑制率明顯高于超濾前的玉米黃粉水解液，為88.73%。

本研究發(fā)現(xiàn)Flavourzyme水解產(chǎn)物雖然ACE抑制率較高，但水解液中可溶性蛋白含量較低。因此，需要進(jìn)一步研究以提高蛋白回收率，并開發(fā)具有較高ACE抑制活性的低苦味玉米肽產(chǎn)品。隨著人們自我保健意識(shí)和安全意識(shí)的增強(qiáng)，這類藥食兩用的天然降血壓活性肽產(chǎn)品越來(lái)越受到人們的青睞，具有廣闊的發(fā)展前景。

1 封梅，陳季旺，王慧溪，等.酶解蛋白質(zhì)制備降血壓肽的研究進(jìn)展［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，26（3）：25～27.

2 Wenjuan Qu，Haile Ma，Zhongli Pan，et al.Preparation and antihypertensive activity of peptides from Porphyra yezoensis［J］.Food Chemistry，2010（123）：14～20.

3 Won－Kyo Jung，Eresha Mendis，Jae－Young Je，et al.Angiotensin I－converting enzyme inhibitory peptide from yellown sole （Limanda aspera）frame protein and its antihypertensive eect in spontaneously hypertensive rat［J］.Food Chemistry，2006（94）：26～32.

4 宋占蘭，鄭喜群，劉曉蘭.Alcalase酶解高底物濃度玉米蛋白工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2011，27（6）：226～231.

5 郭玲玲.國(guó)內(nèi)外玉米加工現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.農(nóng)業(yè)科技與裝備，2010（9）：8～10.

6 敬珊珊，劉曉蘭，鄭喜群.玉米蛋白加工利用研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2012，28（1）：259～263.

7 Kim J M，Whang J H，Suh H J.Enhancement of angiotension I－converting enzyme inhibitory activity and improvement of the emulsifying and foaming properties of corn gluten hydrolysate using ultrafiltration membranes［J］.Eur Food Res Technol，2004（218）：133～138.

8 鄭喜群.玉米黃粉的酶解工藝與抗氧化活性肽的制備［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

9 Cushman D W，Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin－coverting enzyme of rabbit lung［J］.Biochem Pharmacol，1971（20）：1 637～1 648.

10 劉萍，陳黎斌，楊嚴(yán)俊.酶解玉米蛋白制備降血壓肽的研究［J］.食品工業(yè)科，2006，27（5）：117～122.

11 劉志國(guó)，陳江源，王亞林.玉米醇溶蛋白酶解制備ACE抑制肽［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（2）：138～141.