miRNA在腫瘤早期診斷中的價值及其檢測技術(shù)進展

徐 怡，陳光明，宓現(xiàn)強

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093;2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210)

惡性腫瘤是一種死亡率很高的疾病，2005年全球死亡人數(shù)5800萬中死于癌癥的760萬，占總數(shù)13%[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織最近發(fā)表《世界癌癥報告》說，今后數(shù)年將是全球癌癥高發(fā)年份，如各國不采取緊急措施，到2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%，全球每年新增患者人數(shù)將達1500萬人。解決腫瘤高死亡率的途徑之一是對腫瘤進行有效的控制和預(yù)防，而控制和預(yù)防最大的難題是如何能盡可能早的發(fā)現(xiàn)腫瘤，從而針對性的采用最有效的手段進行治療。

腫瘤患者死亡率的不斷升高，使得越來越多的研究人員致力于腫瘤研究，在其診斷和治療方面取得了不少進展，其中腫瘤診斷方面，miRNA作為一種新的腫瘤標志物是腫瘤診斷研究的熱點。

一、腫瘤標志物的新熱點——miRNA及其檢測技術(shù)

1.miRNA簡介及優(yōu)勢 miRNA(microRNA，微小RNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，存在于不同生物中，在Drosha R Nase的作用下由pri-miRNA剪切成為70～100個核苷酸長度的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，pre-miRNA在Dicer酶作用下被剪切成19～25個核苷酸長度的成熟 RNA，即 miRNA[3]。成熟miRNA通過與目標mRNA的3'端非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)特異性互補，導(dǎo)致mRNA翻譯受到抑制[4]。miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，據(jù)統(tǒng)計miRNA調(diào)節(jié)了人類30%基因功能[3]，參與了一系列生命活動，包括細胞增殖及凋亡、器官形成、造血過程、發(fā)育進程等，與腫瘤的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后等有著密切關(guān)系，腫瘤中超過50%的miRNAs基因位于染色體脆性位點或染色體擴增、缺失或轉(zhuǎn)位區(qū)域[5]，相比于蛋白質(zhì)標志物，miRNA表達異常出現(xiàn)的更早(圖1)，對早期診斷更加有利，也更適合作為作為腫瘤診斷標志物，從而成為研究熱點之一[6-8]。

圖1 腫瘤過程及生物標志物的確定

腫瘤標志物檢測是真正能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤早期診斷的方法，miRNA的診斷優(yōu)勢從以下實驗事例中有充分體現(xiàn)，Maitra A等[9]的一項研究表明血清中miRNA能很好的區(qū)分腫瘤患者和健康人群，這為在血漿或血清中檢查miRNA表達的變化情況，為基于血液樣品的人類癌癥檢測提供了依據(jù)。Mitchell，P.S 等[10]試圖通過實驗方法確定來源于血漿和血清樣本的miRNA是否會有本質(zhì)的不同，該實驗組的檢測樣本來自同一患者的同一次抽血。實驗結(jié)果表明無論對血漿還是血清樣本進行檢測，miRNA都可以作為基于血液檢測的穩(wěn)定的標志物。Keller等[11]對臨床454例不同疾病患者血清樣本進行芯片分析，包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、腎母細胞瘤、胰腺腫瘤等腫瘤患者以及對照個體。結(jié)果顯示863種miRNAs中有多達62種miRNA在6種疾病中表達下調(diào);24種miRNA在14種疾病中表達下調(diào);同時也有121種miRNA在所有的14種疾病中正常表達。這一研究結(jié)果說明miRNA對于腫瘤有很好的顯示作用，使得根據(jù)血清中miRNA的表達情況確定患者患病情況成為可能。Hennessey，P.T等[12]針對非小細胞肺癌的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中的2種miRNA:miR-15b和miR-27b的不同表達情況能夠很好的區(qū)分非小細胞肺癌和健康人群，并且特異性很高。該研究結(jié)果不僅證實了前人對于循環(huán)miRNA對篩查非小細胞肺癌有很重要的作用[12-14]的結(jié)論.同時也充分顯示血清中miRNA的不同表達情況對于非小細胞肺癌來說具有很高的診斷價值，并且可能成為患者確診前的最有效的診斷依據(jù)。上述幾例實驗充分證明miRNA是特異性很強的腫瘤早期診斷標志物。Rui Liu等[15]用197例胰腺癌血清樣本，對胰腺癌早期標志物進行研究，結(jié)果顯示該研究組所選擇的7種miRNA同時檢測的準確率為86.3%，而單獨的糖類抗原(CA)19-9檢測準確率為56.4%，癌胚抗原(CEA)僅為36.4%。這充分說明miRNA相比于蛋白類標志物具有優(yōu)勢，也從另一方面說明多個靶分子同時檢測的重要性。

從上述實驗事例可以看出miRNAs表達異常對腫瘤有很好的鑒別作用[5，16-17]。這為腫瘤實現(xiàn)早期診斷提供了方向。miRNA不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用，可以作為癌癥診斷和預(yù)后判斷的重要標志物。同時miRNA具有以下五大優(yōu)點:(1)miRNA在正常人外周血中表達穩(wěn)定且可以穩(wěn)定存在，無顯著的個體差異[18-21];(2)血清或血漿中miRNA在室溫下孵育24 h或者以上、反復(fù)凍融(可高達8個凍融周期)、過酸、過堿、甚至煮沸條件下不易降解[22-28，10];(3)miRNA 表達水平的變化與惡性腫瘤的病理過程密切相關(guān);(4)血清中miRNA的異常表達可作為腫瘤細胞存在的直接證據(jù)，具有很好的生物學(xué)標志物價值[29-31];(5)miRNA相比于蛋白標志物不僅檢測準確率更高，且更易于實現(xiàn)多組分同時檢測，優(yōu)越性明顯。

2.生物信息學(xué)在miRNA標志物發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化中的作用 近年來隨著對miRNA研究的增多，不同物種中數(shù)以百計的miRNA已直接由克隆技術(shù)和計算方法確定，但是仍有很多miRNA由于相對分子質(zhì)量較小或者序列特異性等問題不能僅僅依靠序列信息就可以確定，而是需要了解miRNA前體的結(jié)構(gòu)信息才可以確定[32-33]。生物信息學(xué)在這方面是一種非常有價值的研究方法[34]。生物信息學(xué)通過計算機和信息技術(shù)結(jié)合，對生物實驗數(shù)據(jù)進行分析和計算，對于實驗方法實驗結(jié)果是一種非常有價值的補充。Mizuguchi，Y等[35]研究表明通過生物信息學(xué)所確定的miRNA相比于個體miRNA研究或者其他臨床病理研究等方法，對于高危人群的預(yù)后狀況分析效果更好。因此生物信息學(xué)技術(shù)能夠成為生物知識和臨床治療之間相結(jié)合的橋梁。生物信息學(xué)及其相關(guān)技術(shù)能夠促進新的靶點的快速識別，從而可以推進研究更快的進入到實驗驗證階段[36]。

同時生物信息學(xué)在多靶點的確定方面有著不可忽視的作用。目前臨床上對于腫瘤標志物診斷方法仍多為單組份檢測，而單組份檢測存在特異性不高、靈敏度不強等缺陷，多組分同時檢測恰恰能夠克服單組份檢測的缺陷，靈敏度和特異性都有很大的提高。本文前面所提到Rui Liu等的實驗數(shù)據(jù)也說明多組分相比于單組份的優(yōu)勢，而尋找同時檢測的多組分靶點也成為了非常重要的一部分，生物信息學(xué)對于新型標志物miRNA的確定以及多靶點的組合方面有重要作用，根據(jù)生物信息學(xué)計算結(jié)果結(jié)合相關(guān)驗證實驗可以更快的確定腫瘤標志物最佳組合，從而更快的推動腫瘤標志物多組分同時檢測。

3.用于腫瘤早期診斷的miRNA檢測技術(shù) 在腫瘤的早期診斷中，除了標志物的選擇和檢測樣本的確定外，檢測方法也是提高腫瘤檢測特異性的一個很重要方面。目前miRNA的檢測有以下幾種方法，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)、熒光原位雜交(FISH)等。其中RT-PCR檢測方法最為常用，主要分為探針法和染料法2種，由于miRNA在血清中濃度低，因此反應(yīng)所需循環(huán)次數(shù)多，持續(xù)時間長。目前國內(nèi)腫瘤核酸定量檢測試劑盒仍處于科學(xué)研究階段;FISH相對簡單，國內(nèi)外已有腫瘤組織細胞檢測試劑盒，然而miR-NAs原位檢測系統(tǒng)相對較少，主要的原因是低拷貝、片段小。

分子信標檢測技術(shù)是能夠?qū)崿F(xiàn)對miRNA進行簡便快速檢測的檢測方法。分子信標是一段寡核苷酸，主要由4個部分組成:環(huán)、莖、熒光基團和猝滅基團，分子信標具有能夠很好的和靶點miRNA特異性結(jié)合的特點，因此只有當檢測樣本中存在檢測靶點，分子信標才會與之結(jié)合，與此同時，分子信標熒光基團和猝滅基團打開，從而可以檢測到熒光的存在。這一特點使得檢測的特異性大大提高。普通分子信標常用的熒光基團和猝滅基團為傳統(tǒng)有機染料，但是有機染料存在著吸收光譜較寬，而發(fā)射光譜較窄、抗光漂白性較差等缺點[37]。為此，近年來很多學(xué)者和專家開始更多的關(guān)注量子點技術(shù)。

量子點是一種無機納米材料，具有發(fā)光強度強，經(jīng)過測定單個量子點比有機染料明亮大概10～20倍[38-39]、且具有發(fā)射波長可以由自身尺寸大小變化而變化等優(yōu)點，通過不同尺寸的量子點與分子信標結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)對多種miRNA的同時檢測。將量子點和分子信標技術(shù)結(jié)合，能夠使兩者優(yōu)勢互補，非常便于實現(xiàn)建立快速、簡便、高效的腫瘤標志物早期診斷新技術(shù)，對腫瘤的早期診斷的實現(xiàn)有重大的意義。

三、總結(jié)

綜上所述，腫瘤診斷方面影像學(xué)有不可忽視的作用，但是由于自身局限性很難實現(xiàn)早期診斷，而傳統(tǒng)標志物診斷由于特異性不強，靈敏度不高而影響診斷效果。檢測標志物、檢測對象及檢測方法共同決定了惡性腫瘤的早期診斷效果，miRNA、生物信息學(xué)以及分子信標檢測技術(shù)三者相結(jié)合，對于實現(xiàn)惡性腫瘤早期診斷有巨大的推動作用。

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