畫眉草多糖提取及其保濕性能研究

祝士惠，孫培冬，李海洋

江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

畫眉草(Herba Eragrostidis Pilosae)原產(chǎn)地為埃塞爾比亞，在當(dāng)?shù)刈鳛楣任锓N植。由于它在干旱和洪澇等惡劣氣候條件下均能存活［1］，因此在世界各地廣泛分布，在我國的東北、華北、華東及華南均有生長。畫眉草富含礦物質(zhì)［2］和蛋白質(zhì)［3］，《植物名實圖考》、《東北常用中草藥手冊》等書中記載畫眉草具有清熱解毒、化瘀止血、治淋證、跌打損傷、腎盂腎炎、尿路感染、膿皰瘡等功效。目前國內(nèi)對畫眉草的研究較少，對其活性成分及應(yīng)用未見報道。

近幾年來從天然植物中提取具有營養(yǎng)和保濕雙重功效的天然保濕劑是研究的熱點，天然多糖是其中最重要的營養(yǎng)保濕材料［4}。本文用纖維素酶超聲輔助法從畫眉草中提取多糖，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步鑒定，探究了畫眉草多糖的保濕及吸濕性能，為開發(fā)利用畫眉草資源提供了思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

畫眉草，屬大畫眉草品種，采自山東省煙臺市山區(qū)。無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、苯酚、硫酸銨、碳酸鉀、甘油、聚乙二醇400，1，3-丁二醇，纖維素酶、DEAE-纖維素，均為分析純，國藥化學(xué)有限公司;低粘度殼聚糖，Sigma公司;葡聚糖凝膠G-50，上海雅吉生物科技有限公司;透析袋3500 Da，上海聚源生物科技有限公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司。

1.1.2 儀器

粉碎機(JFSD-100-II型，上海嘉定糧油儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE5203型，上海亞榮生化儀器廠);超聲波儀器(BX3300LH型，上海新苗醫(yī)療器械有限公司);紫外-可見分光光度計(TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司);傅里葉紅外光譜儀(FALA2000101型，Boman公司);高效液相色譜儀(HP1100型，美國安捷倫有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取、分離純化

稱取畫眉草100 g，粉碎后用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇80℃下脫脂2 h;過濾，取濾渣晾干，加入纖維素酶1 g，在固液比1∶20，pH=5，溫度50 ℃ ，時間4 h條件下水提取。然后在頻率40 KHz的超聲儀器中超聲10 min，90℃滅活，過濾得濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，加4倍體積乙醇沉淀，離心收集沉淀，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，沉淀物真空干燥得粗糖浸膏。將粗糖加200 mL水溶解，用加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%胰蛋白酶脫蛋白、活性炭脫色后，用乙醇沉淀并洗滌得混合多糖，混合多糖得率為3.45%。最后將混合多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，用蒸餾水、0.1、0.3、0.5 mol/L 的 NaCl洗脫，用苯酚-硫酸法［5］測定洗脫曲線，合并單一洗脫峰的多糖液體經(jīng)透析脫鹽后，真空干燥得到純化后多糖。采用Sephadex G-50凝膠柱層析，用0.1 moL/L的NaCl為洗脫液，對得到的純化后多糖進(jìn)行純度鑒定。

1.2.2 分子量測定

稱取一定量的純化后多糖，配成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的水溶液，采用高效凝膠滲透色譜儀(HPGPC)測定多糖分子量分布［6］。色譜條件:色譜柱Ultrahydrogel Linear，長度3 m，內(nèi)徑7.8 mm;2410 示差折光檢測器;流動相0.1mol/L NaNO3溶液;流速0.9 mL/min;柱溫45 ℃。

1.2.3 單糖成分分析

樣品配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL，取200 μL加入4 mol/L的三氟乙酸，用氮氣封管在110℃下水解2 h。冷卻到室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸。采用高效離子色譜法(HPIC)，進(jìn)行單糖組成分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的對比，確定多糖中單糖的組成。

色譜條件:分離柱CarboPacTMpA20預(yù)處理柱、CarboPacTMpA20檢測柱;脈沖安培檢測器;流動相0.5 mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用單一濃度淋洗;流速0.45 mL/min;溫度30℃。

1.2.4 吸濕和保濕性能

將飽和硫酸銨溶液、飽和碳酸鉀溶液分別置于干燥器內(nèi)，放置于20℃的恒溫箱中，制成相當(dāng)濕度為81%和43%的環(huán)境［7］。

稱取多糖 TPS1、TPS2、TPS3 各 0.10 g，分別置于相對濕度RH 43%和81%的密閉容器內(nèi)吸濕12 h后稱重求吸濕率［8］。吸濕率 (%)=(w1-w0)×100/w0，w0和w1為樣品吸濕前、后的的重量。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的多糖TPS1、TPS2、TPS3溶液，置于相對濕度RH 43%和81%的環(huán)境中，12 h后稱重求保濕率。保濕率(%)=H1×100/H0，H1、H0為放置前后溶液中水分重量。

選取吸濕和保濕性能最好的TPS2多糖，與常用保濕劑甘油、聚乙二醇400、1，3-丁二醇、殼聚糖在不同時間后比較其保濕和吸濕性能，操作同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取、分離純化

畫眉草經(jīng)纖維素酶-超聲輔助提取，粗糖的提取率為30.52%。粗糖經(jīng)脫蛋白后，紫外檢測在260 nm和280 nm處均無吸收，表明混合多糖中不含蛋白質(zhì)［9］?；旌咸墙?jīng)DEAE-纖維素柱分離純化，洗脫曲線見圖1。

根據(jù)洗脫曲線收集得到3種多糖，以水為洗脫劑得到一種中性多糖 TPS1，0.1、0.3 mol/L 的 NaCl洗脫分別得到兩種酸性多糖TPS2、TPS3。真空干燥，純化后3種多糖TPS1、TPS2、TPS3的得率分別為 0.42%、0.66%、0.54%。

采用Sephadex G-50凝膠柱層析，用0.1moL/L的NaCl為洗脫液對3種多糖進(jìn)行洗脫，3種多糖均得到單一對稱峰，洗脫曲線如圖2所示。

2.2 多糖的分子量測定

高效凝膠滲透色譜(HPGPC)分析得到3種多糖TPS1、TPS2、TPS3的均重分子量分別為7886 Da、8467 Da、6366 Da。

2.3 單糖成分分析

通過標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，確定多糖的單糖組成，TPS1、TPS2、TPS3水解后經(jīng)高效離子色譜(HPIC)分析結(jié)果見下圖。

圖3 TPS1、TPS2、TPS3 的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of TPS1、TPS2、TPS3

通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品離子譜圖對比可知，TPS1組成單糖為果糖，TPS2、TPS3均含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、一種未知糖。TPS2多糖中葡萄糖含量最高，為44.0%。TPS3果糖含量最高，為45.5%。

表1 多糖12 h后的吸濕和保濕率Table 1 The absorption and retention rate of actors level of polysaccharides after 12 hours

2.4 多糖的吸濕和保濕性能研究

2.4.1 多糖的吸濕和保濕性能比較

從表1可以看出:3種多糖在相對濕度(RH)43%的環(huán)境中，TPS2的吸濕和保濕率略高于其它兩種多糖;但在相對濕度(RH)81%的環(huán)境中，TPS2表現(xiàn)出了明顯的吸濕和保濕性能，所以對吸濕和保濕性能優(yōu)良的TPS2進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2.4.2 TPS2吸濕性隨時間的變化

TPS2多糖、甘油、聚乙二醇400、殼聚糖各的吸濕率測定結(jié)果見圖3，在相對濕度為43%條件下，吸濕率大小為TPS2＞聚乙二醇400＞甘油＞殼聚糖，TPS2的吸濕性能明顯高于聚乙二醇400、甘油和殼聚糖。TPS2在24 h之前吸濕率變化比較顯著，在36 h后吸濕率變化緩慢，吸濕率基本達(dá)到飽和狀態(tài)，48 h達(dá)到最大吸濕率為36.14%。殼聚糖在12 h后吸收率就達(dá)到飽和;聚乙二醇400和甘油的吸濕率均隨著時間的增加而增大，48 h時聚乙二醇400和甘油的吸濕率相當(dāng)。在相對濕度為81%條件下，TPS2表現(xiàn)出了良好的吸濕性能，隨著時間的增加吸濕率不斷增加，48 h后仍未達(dá)到吸濕飽和，最大吸濕率為70.65%。殼聚糖在12 h后達(dá)到吸濕平衡，甘油和聚乙二醇400在36 h后吸濕率變化緩慢，最大吸濕率均低于41%。從圖3可以看出，多糖TPS2有顯著的吸濕效果，最大吸濕率明顯高于聚乙二醇400、甘油和殼聚糖常用保濕劑。

圖4 TPS2和常用保濕劑吸濕率隨時間的變化圖Fig.4 Relationship between moisture absorption rate and time.

2.4.3 TPS2保濕性隨時間的變化

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的多糖TPS2溶液、聚乙二醇400溶液、殼聚糖溶液和5.0%的甘油溶液，分別置于相對濕度RH 43%和RH 81%的密閉容器內(nèi)，保濕率測定結(jié)果見圖5。

圖5 3種多糖和常用保濕劑保濕率隨時間的變化圖Fig.5 Relationship between moisture retention rate and time

在相對濕度為43%條件下，TPS2、甘油、聚乙二醇400、殼聚糖的保濕率均隨著時間的變化而減少，保濕率大小為TPS2＞殼聚糖＞甘油＞聚乙二醇400，TPS2未表現(xiàn)出明顯的保濕效果。在相對濕度為81%條件下，TPS2的保濕率隨著時間的變化先增大后減少，在24 h時達(dá)到最大，保濕率103.29%，保濕率明顯高于甘油、聚乙二醇400、殼聚糖。

3 結(jié)論

本文首次從畫眉草中提取分離出了3種多糖TPS1、TPS2、TPS3，提取率分別為 0.42%、0.66%、0.54%。3種多糖均為小分子多糖，分子量分別為7886 Da、8467 Da、6366 Da。TPS1 單糖組成為果糖，TPS2、TPS3單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖和一種未知糖。

由于畫眉草是一種耐旱性植物，推測其可能有良好的保濕性能，本文著重對分子量較大的多糖TPS2進(jìn)行了保濕和吸濕性能的初步探究，與常用保濕劑在相對濕度(RH)43%和81%下進(jìn)行了比較，表明TPS2的保濕和吸濕能力優(yōu)于常用保濕劑甘油、聚乙二醇400和殼聚糖，是一種優(yōu)良的保濕劑。

多糖是一種天然高分子多聚物，通常具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗過敏等活性，民間有采用傳統(tǒng)的煎煮畫眉草的方法來治療白血病并有一定的效果，畫眉草多糖是一種具有研究價值的天然提取物。后續(xù)工作將進(jìn)一步探討畫眉草多糖的其他應(yīng)用性能，并對其單糖糖苷鍵的連接方式和特征活性集團(tuán)進(jìn)行分析，以開發(fā)和利用畫眉草多糖天然提取物。

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