蚯蚓GSH-Px提取與純化的研究

商桂娜，榮永海，榮 龍

北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191

《本草綱目》中記載蚯蚓(earthworm)是通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防治療心腦血管疾病的重要藥物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)存在著多種活性成分，從其體內(nèi)提取的蚓激酶和抗菌肽等物質(zhì)具有重要的醫(yī)用價(jià)值。另外有研究顯示，蚯蚓體內(nèi)存在著多種抗氧化酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶即為其中一種。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，簡(jiǎn)稱GSHPx)是存在于生物體內(nèi)的重要的含硒酶。GSH-Px分子量為76～98 kD，由4個(gè)幾乎相同的亞基組成。GSH-Px主要的生理作用是清除有機(jī)氫過(guò)氧化物，并在過(guò)氧化氫酶含量很少或H2O2產(chǎn)量很低的組織中，可代替過(guò)氧化氫酶清除H2O2，所以該酶有防止畸變、預(yù)防衰老及參與前列腺素合成等重要作用［1］。

目前，國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)是以人體肝臟［2］，洋蔥［3］等生物體為原材料進(jìn)行了GSH-Px提取與純化;國(guó)外的文獻(xiàn)是以人體血液［4］，金槍魚(yú)肝臟［5］等生物體為原材料進(jìn)行了GSH-Px提取與純化，但尚無(wú)從蚯蚓體內(nèi)提取與純化GSH-Px的報(bào)道。由于動(dòng)物的血液、肝臟均不易大批量獲得，且在提取的過(guò)程中需要抗凝措施等的處理，大大限制了GSH-Px的規(guī)模生產(chǎn)。本文利用蚯蚓進(jìn)行GSH-Px的分離純化，擴(kuò)大了GSH-Px原料的來(lái)源。

另外，近年來(lái)，GSH-Px 的提取多用勻漿［2，5］的方法。閃式提取法是中藥提取的一項(xiàng)新技術(shù)，其原理是在適當(dāng)溶劑存在的條件下，利用高速機(jī)械剪切力和超速動(dòng)態(tài)分子滲透作用，迅速破壞細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分或有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，通過(guò)過(guò)濾達(dá)到提取的目的。與傳統(tǒng)方法相比，具有高效、快速、不需加熱、不破壞成分、適宜各種溶劑等優(yōu)勢(shì)［6］。已有報(bào)道將閃式提取技術(shù)應(yīng)用于皂甙類物質(zhì)的研究［7］，獲得較好的效果。在GSH-Px的提取方面還未見(jiàn)有閃式提取技術(shù)應(yīng)用的報(bào)道。因此，閃式提取技術(shù)的應(yīng)用是本研究的另一特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

實(shí)驗(yàn)用蚯蚓選用的品種為赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia fetida)，由天津蚓福生物科技開(kāi)發(fā)有限公司提供;硫酸銨購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose)購(gòu)自上海躍騰生物科技有限公司;葡聚糖凝膠G-100(Sephadex G-100)購(gòu)自美國(guó)Pharmacia公司;GSH-Px活性檢測(cè)用DTNB購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;蛋白檢測(cè)用牛血清蛋白購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;蛋白檢測(cè)用考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司，其余試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;全部試劑均為分析純或色譜純等級(jí);所有溶液均以雙蒸水配制而成。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JHBE-50型閃式提取器，河南金鼎科技發(fā)展有限公司;ArantiTMJ-25型低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司;868型酸度計(jì)，美國(guó)Orion公司;蛋白純化層析柱，上海錦華層析設(shè)備廠;FC-95A自動(dòng)餾分收集器，北京新技術(shù)應(yīng)用研究所;雙蒸水過(guò)濾器，美國(guó)PALL公司;SP-756P型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GSH-Px 的提取

1.3.1.1 超聲波提取法、組織勻漿法及閃式提取法提取蚯蚓GSH-Px的條件

取冷凍新鮮的蚯蚓(已洗凈)300 g，平均分為3份，剪碎，分別用超聲波提取法、組織勻漿法和閃式提取法進(jìn)行提取。3種方法的提取條件如下:

超聲波提取條件為以純水為提取溶劑，料液質(zhì)量比1∶3，功率為800 W，常溫下提取2次，每次30 min;

組織勻漿提取條件為以純水為提取溶劑，料液質(zhì)量比1∶3，常溫下提取2次，每次30 s;

閃式提取條件為以純水為提取溶劑，料液質(zhì)量比為1∶3，閃提轉(zhuǎn)速為3500 rpm，常溫下提取2次，每次30 s，每次間歇5 min。

提取完成后，置于-70℃ 冰箱冷凍12 h，取出融化，11000×g 4℃離心1 h，收集上清液即為GSH-Px粗提液，測(cè)定3種不同方法提取的GSH-Px的總活性。

1.3.1.2 閃式提取法提取蚯蚓GSH-Px條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了影響蚯蚓GSHPx提取的因素主要有料液比、提取液的pH值、閃提時(shí)間和閃提電壓并確定了各因素條件的適用范圍。為優(yōu)選蚯蚓GSH-Px分離提取工藝，選取料液比(A)、提取液的pH值(B)和閃提時(shí)間(C)，設(shè)計(jì)3因素3水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素和水平表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

正交實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行9組，每組取100 g冷凍新鮮(已洗凈)的蚯蚓，按正交實(shí)驗(yàn)表中的條件進(jìn)行閃式提取，提取完成后，置于-70℃ 冰箱冷凍12 h，取出融化，11000×g 4℃離心1 h，收集上清液，提取后每組測(cè)定GSH-Px總活性。

1.3.2 GSH-Px 的純化

1.3.2.1 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。其原理是硫酸銨親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量硫酸銨后，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀［8］。

將GSH-Px粗提液加入硫酸銨至50%的飽和度，在-20℃靜置1 h，11000×g 4℃離心40 min，棄上清液，沉淀用5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)溶解。然后在4℃下透析，先用蒸餾水透析1 h，然后用上述緩沖液透析2 h，測(cè)定透析后溶液中GSH-Px的總活性。

1.3.2.2 選擇性酸堿變性

該方法主要是利用蛋白質(zhì)對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變形沉淀［8］。將透析液調(diào)節(jié)pH 5.0，11000×g/min 4℃離心15 min，收集上清，將pH調(diào)到7.2，用5 mmol/L，pH=7.2 的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)4℃透析2 h，測(cè)定透析后溶液中GSH-Px的總活性。

1.3.2.3 DEAE-Cellulose 柱

DEAE-Cellulose柱是離子交換層析柱的一種，它利用不同的蛋白質(zhì)的表面帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強(qiáng)弱不同，因此所需的洗脫劑強(qiáng)度不同來(lái)進(jìn)行物質(zhì)分離［8］。

DEAE-Cellulose裝柱后用 5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)平衡。透析后的GSH-Px液上DEAE-Cellulose柱(1.6×30 cm)，然后用含有0～500 mmol/L NaCl的上述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為20 mL/h，每管收集10 mL收集酶活性峰。測(cè)定每管GSH-Px活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的管，用5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)4℃透析2 h。

1.3.2.4 Sephadex G-100 柱

Sephadex G-100柱是凝膠過(guò)濾層析柱的一種，這種凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它利用蛋白質(zhì)分子大小不同，進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，較大的分子先被洗脫下來(lái)，較小的分子后被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離目的［8］。

Sephadex G-100 上柱后用5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)平衡，透析后的GSH-Px酶液經(jīng)PEG-4000脫水后上Sephadex G-100柱(2.6×70 cm)。然后用上述緩沖液洗脫，分管收集，流速為20 mL/h，每管收集10 mL。測(cè)定每管GSH-Px活性和蛋白質(zhì)含量，收集GSH-Px活性較高的管，得到GSH-Px純化后的樣品。

1.3.3 蚯蚓GSH-Px提取和純化的總工藝

圖1 蚯蚓GSH-Px提取與純化的工藝Fig.1 Extraction and purification process of earthworm GSH-Px

1.3.4 GSH-Px 活性檢測(cè)方法

采用DTNB直接法［9］，在GSH作為氫供體的條件下，GSH-Px可使H2O2還原為H2O。

酶活性單位定義:為1 mL蚯蚓提取液，37℃，pH=7.0條件下反應(yīng)1 min，扣除非酶反應(yīng)后，使GSH濃度下降1 μmol為1個(gè)酶活力單位。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

采用考馬斯亮蘭法(Bradford法)［10］，實(shí)驗(yàn)以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 SDS-PAGE進(jìn)行GSH-Px純度鑒定及亞基分子量的測(cè)定

采用SDS-聚丙烯酰胺垂直平板電泳進(jìn)行GSHPx的純度鑒定并測(cè)定其亞基分子量，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，使用考馬斯亮藍(lán)G-250染色。

1.3.7 熱穩(wěn)定性

將蚯蚓GSH-Px溶解在將蚯蚓GSH-Px溶解在pH=7.4，20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，然后分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃孵育1 h，測(cè)定酶活性。

1.3.8 pH 穩(wěn)定性

將蚯蚓GSH-Px分別在100 mmol/L的pH 3.0～6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、100 mmol/L的pH 7.0 ～8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、100 mmol/L 的pH 9.0 ～ 11.0 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液在20℃水浴中孵育2 h，測(cè)定酶活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 超聲波提取法、組織勻漿提取法和閃式提取法的比較

三種不同的提取方法提取條件及效果比較如表2所示。閃式提取法從100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的酶總活力，高于超聲波提取法和組織勻漿法，但是與超聲法相比，提取時(shí)間顯著縮短。充分說(shuō)明閃式提取效率高，提取速度快，是一種較為便捷的提取方法。

表1 不同提取方法提取條件和提取的GSH-Px的總活力比較Table 2 Comparison of extraction conditions of different extraction methods and the total activity of GSH-Px

2.2 閃提單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)蚯蚓GSH-Px總活力的影響

由圖2可知，在閃提緩沖液pH值為7.5，閃提時(shí)間為1 min，閃提電壓為110 V的條件下，料液比從1∶1到1∶4時(shí)，隨著料液比的增加，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力也逐漸增加。料液比1∶4后提取的GSH-Px總活力增加不明顯。

2.2.2 pH值對(duì)蚯蚓GSH-Px總活力的影響

由圖3可知，在料液比為1∶4，閃提時(shí)間為1 min，閃提電壓為110 V的條件下，隨著pH值得升高，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在pH 6.5后趨于穩(wěn)定。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)蚯蚓GSH-Px總活力的影響

從圖4可以看出，在閃提料液比為1∶4，緩沖液pH值為7.5，閃提電壓為110 V的條件下，提取時(shí)間在1 min以內(nèi)，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力隨著提取時(shí)間的增加有顯著的增加;提取時(shí)間超過(guò)1 min后，收率基本無(wú)變化。

圖4 提取時(shí)間對(duì)于蚯蚓GSH-Px總活力的影響Fig.4 Effect of the extraction time on the total activity of GSH-Px

2.2.4 閃提電壓對(duì)蚯蚓GSH-Px總活力的影響

閃提電壓與轉(zhuǎn)速成正比，因此閃提電壓間接影響GSH-Px的提取效果。從圖5可以看出，在閃提料液比為1∶4，緩沖液pH值為7.5，提取時(shí)間1 min的條件下，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力，受電壓影響很小，隨著電壓的增加，提取的酶活性基本穩(wěn)定，因此，閃提取能耗最低的110 V作為提取電壓。

圖5 提取電壓對(duì)于蚯蚓GSH-Px總活力的影響Fig.5 Effect of the extraction voltage on the total activity of GSHPx

2.3 提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

以蚯蚓GSH-Px收率作為考察指標(biāo)，選用L9(33)正交表安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，不考慮交互作用進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

從正交設(shè)計(jì)的結(jié)果，我們可以初步得知，影響蚯蚓體內(nèi)GSH-Px提取的因素的主次順序是B＞A＞C，即提取緩沖液的pH值影響最大，然后是料液比，影響最小的提取時(shí)間。然后通過(guò)方差分析表4可以看出，閃式提取緩沖液的pH值對(duì)于GSH-Px的提取效果具有顯著性影響。正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的最佳條件為A3B3C1，即閃式提取物料加入6倍，pH=8.0的緩沖液，提取時(shí)間為1 min，分2次提取，每次30 s。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述最佳條件A3B3C1進(jìn)行3次驗(yàn)證提取實(shí)驗(yàn)，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力分別為16524 u、15973 u、16206 u，平均為 16234 u。

表3 正交設(shè)計(jì)的結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.5 蚯蚓GSH-Px純化的結(jié)果

蚯蚓中GSH-Px的純化，結(jié)果總結(jié)于表5，DEAE-cellulose柱洗脫曲線見(jiàn)圖6，葡聚糖凝膠G-100柱洗脫曲線見(jiàn)圖7。經(jīng)上述工藝后，GSH-Px的比活達(dá)到了157.08 U/mg，比活性在市售人類紅細(xì)胞GSH-Px(≥30 U/mg protein，Sigma)和市售牛紅細(xì)胞GSH-Px(≥300 U/mg protein，Sigma)之間。

表5 蚯蚓GSH-Px純化結(jié)果Table 5 Purification of earthworm GSH-Px

*回收率為每一步純化后，酶總活力占粗提液中酶總活力的百分比*Yield is defined as the percentage of the total activity after every purification step to the total activity of the crude extract

2.6 SDS-PAGE 電泳結(jié)果

純化的蚯蚓GSH-Px經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后為單一條帶，測(cè)得其亞基分子量約為26 kD，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 8。這與 Thompson JL 等［5］從南方藍(lán)鰭金槍魚(yú)肝臟中純化的GSH-Px(24 kD)相近。GSH-Px由4個(gè)相同亞基組成，因此推測(cè)本研究中純化的GSH-Px分子量約為104 kD，這與Awasthi YC等［4］從人紅細(xì)胞純化的GSH-Px分子量相近(95+3 kD)。

2.7 蚯蚓GSH-Px熱穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，GSH-Px的最適溫度為40℃，在20～40℃熱穩(wěn)定性較好，溫度高于40℃時(shí)，酶活力顯著降低。這與徐蘅等［2］從人肝臟中純化的GSH-Px的性質(zhì)相似:最適溫度為37℃，溫度高于45℃時(shí)，酶活力顯著下降;但與朱繼玲［3］從洋蔥中純化的GSH-Px有部分差異，其純化的GSH-Px在45℃之后，酶活性也顯著降低，但是在20～30℃時(shí)，其酶活性也相對(duì)較低。

圖9 蚯蚓GSH-Px的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of earthworm GSH-Px

2.8 蚯蚓GSH-Px的pH穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，蚯蚓GSH-Px的pH 6～10范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，這提示我們蚯蚓GSH-Px的提取純化、檢測(cè)以及實(shí)際應(yīng)用中，pH值應(yīng)盡量保持在6～10之間，以防止酶活性的大量丟失。這與徐蘅［2］等從人肝中純化的 GSH-Px(最適 pH為8.5，pH小于6時(shí)，酶活性顯著降低)性質(zhì)相似。

另外，純化步驟中使用的選擇性酸堿變性的措施。雖然pH值低于6，對(duì)酶活性有一定影響，但是由于處理時(shí)間較短、活性損失較少、比活顯著提高，而且較上柱等其他處理措施相比，操作簡(jiǎn)單、效率高，因此仍然將其用在了純化的步驟中。

圖10 蚯蚓GSH-Px的pH穩(wěn)定性Fig.10 pH stability of earthworm GSH-Px

3 結(jié)論

在本研究中，我們首次使用蚯蚓作為原材料進(jìn)行GSH-Px的提取，并確立了蚯蚓GSH-Px提取與純化的工藝。經(jīng)過(guò)一系列的純化處理，獲得的樣品比活達(dá)到157.08 U/mg，回收率達(dá)到12.32%。另外，通過(guò)SDS-PAGE鑒定，純化的GSH-Px樣品為單一條帶，一個(gè)亞基的分子量為約為26 kD。

本研究在GSH-Px提取的過(guò)程中首次使用閃式提取技術(shù)，與傳統(tǒng)的提取方法勻漿法和超聲法相比，閃提具有時(shí)間短、效率高的優(yōu)勢(shì)，更適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

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