一株柑橘木虱蟲生真菌的分離與鑒定

鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，張小亞，陳國慶

(浙江省柑桔研究所，浙江臺州 318026)

柑橘木虱 (Diaphorina citri)屬同翅目木虱科，是柑橘、檸檬、黃皮、九里香、枸杞等蕓香科植物新梢期的主要害蟲，也是傳播柑橘黃龍病的唯一自然蟲媒。柑橘黃龍病作為當前柑橘生產(chǎn)上防治最難、威脅最大的一種毀滅性病害，對柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展帶來了嚴重威脅。但目前對該病害尚未獲得有效的防治藥劑，以防治柑橘木虱為主的綜合防治是當前該病害防控的主要辦法。因此，加強對柑橘木虱的防治，無論對于控制柑橘黃龍病的流行還是降低蟲體本身對柑橘的危害都具有重要意義。

目前對柑橘木虱的防治多采用化學防治措施，由此造成了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生物多樣性破壞和柑橘木虱抗藥性等諸多問題，而生物農(nóng)藥以其高效、低毒、低殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性和原料易得等特性被認為是未來化學農(nóng)藥的理想替代藥劑。國內外研究者在利用植物提取物、昆蟲天敵和生防菌等防治柑橘木虱方面進行了諸多有益的嘗試［1］，但研究多處于實驗室階段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用生防菌制劑成功防治的實例尚未見報道。因此，柑橘木虱蟲生真菌的進一步分離篩選和生物潛能的研究，對于促進將來柑橘木虱生物防治的順利開展具有重要的意義。本研究通過采集柑橘木虱蟲體，并從中分離出病原菌，以期篩選出對柑橘木虱具有較強致病力的菌株，以豐富現(xiàn)有的柑橘木虱蟲生真菌資源，為將來柑橘木虱生防菌的開發(fā)利用提供材料。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

分離病原菌所用的柑橘木虱蟲體采集于浙江省臺州市黃巖區(qū)不同柑橘園內;測定病原菌的致病性所用的健康柑橘木虱成蟲為浙江省柑橘研究所溫室中九里香植株上常年繼代飼養(yǎng)的種群。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

dNTP、r－Taq酶等 PCR相關試劑，TaKaRa公司;CTAB、巰基乙醇、異丙醇，Amersco公司;核酸染料GelRed，Biotium公司;凝膠回收試劑盒，Axygen公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

用于病原真菌分離培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基。稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后用熱紗布過濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121℃，高壓滅菌20 min。

1.3 引物

所用引物為擴增真菌ITS區(qū)域的通用引物ITS5(5'－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3') 和 ITS4(5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')，由上海 Invitrogen公司合成。

1.4 病菌的分離純化

將田間采集的柑橘木虱置于無菌離心管中帶回實驗室，對蟲體表面已有肉眼可見菌絲體的柑橘木虱蟲尸，直接放于PDA培養(yǎng)基中;對柑橘木虱活蟲或表面無菌絲的蟲尸，先置于70%乙醇中浸泡30 s，再經(jīng)0.1%升汞浸泡3 min后，用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干蟲體上的水分，再置于PDA培養(yǎng)基中。隨后將各載有蟲體的培養(yǎng)基置于28℃微生物培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至蟲體周圍長出菌絲后，挑取菌絲轉至新的PDA平板上培養(yǎng) (重復此操作2～3次)，待菌落上產(chǎn)生分生孢子，用無菌水洗脫分生孢子制備成分生孢子懸浮液，然后用稀釋純化法對病菌進行單孢分離。最后將分離純化獲得的菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4 d后，置于4℃冰箱保存。

1.5 致病菌的篩選

將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)10 d后，以無菌水洗脫菌落上產(chǎn)生的分生孢子，制備分生孢子懸浮液。以血球計數(shù)板確定孢子懸浮液的濃度，并向其中加入適量的吐溫80至終濃度為0.1%。取溫室飼養(yǎng)的健康柑橘木虱成蟲浸沒于含0.1%吐溫80的分生孢子懸浮液中10～15 s，挑取處理后仍能自由活動的柑橘木虱置于培養(yǎng)皿中的九里香葉片上 (培養(yǎng)皿底部鋪有2層用無菌水濕潤過的濾紙，其上放置一個帶有10個左右葉片的九里香嫩枝，枝條底端以無菌水濕潤的脫脂棉包裹)，然后放于28℃光照培養(yǎng)箱中 (每天14 h光照/10 h黑暗，濕度95%以上)培養(yǎng)。上述每處理重復3次，每個重復為30頭柑橘木虱;同時設含0.1%吐溫80的無菌水處理柑橘木虱為對照。于體視顯微鏡下觀察病菌對柑橘木虱的侵染和致死情況，記錄上述各處理的柑橘木虱的總蟲數(shù)和死亡蟲數(shù)，計算死亡率和校正死亡率。

通過上述方法，從處理后的柑橘木虱蟲體中分離病菌，比較再分離的病菌與初始接種病菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，篩選出符合科赫氏法則的對柑橘木虱具致病性的菌株，排除從柑橘木虱蟲體上分離到的腐生菌等非致病菌。

1.6 菌株GJMS032培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

將上述分離純化的菌株GJMS032接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察菌落生長情況，并記錄菌落顏色和形態(tài)。將菌株GJMS032接種到另一PDA培養(yǎng)基平板中央，同時將滅菌后的蓋玻片 (1 cm×1 cm)斜插入距接種點約1 cm處的培養(yǎng)基內，置于28℃恒溫培養(yǎng)約5 d，待菌絲爬到蓋玻片上后，取出蓋玻片置于光學顯微鏡下觀察菌株GJMS032的菌絲和孢子形態(tài)。

1.7 菌株GJMS032的序列分析

1.7.1 總DNA的提取

將菌株GJMS032接種至PDA培養(yǎng)基平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)至菌落長滿整個培養(yǎng)皿，以無菌藥匙刮取平板上生長的真菌菌絲于無菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，采用改良的CTAB法提取菌株GJMS032的總DNA。具體方法為:加入1 mL預熱的2%的CTAB緩沖液及10～20 μL β－巰基乙醇，轉移到1.5 mL離心管中，于65℃水浴30～60 min;加入酚/氯仿/異戊醇 (25∶24∶1)抽提1～2次;再用氯仿/異戊醇 (24∶1)抽提1次;取上清，加入預冷的異丙醇，－20℃放置30～60 min以沉淀DNA;適量75%乙醇洗滌沉淀2次;沉淀于室溫下自然晾干，然后于10～20 μL TE(含RNase 50 mg·L－1)中溶解，所得溶液即為樣品DNA溶液。取1 μL溶液上樣于0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測所提取的DNA質量。

1.7.2 PCR擴增

以提取純化的DNA為模板，以通用引物ITS5和ITS4 擴增菌株 GJMS032 的 ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因。PCR反應體系為:10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物 (10 μmol·L－1)各 1.5 μL，r－TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，無菌水補足至總體積25 μL。反應條件為94℃ 5 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察拍照。

1.7.3 測序及序列分析

于瓊脂糖凝膠上割取PCR產(chǎn)物的目的條帶，利用Axygen膠回收試劑盒回收純化，然后送交至Invitrogen公司利用引物ITS5/ITS4進行兩端測序。利用NCBI Blast對所測序列進行比對分析，查看其與GenBank中已知物種對應序列的相似性。選取GenBank中與之同源性較高的一些菌種的序列，利用Clustal X進行多重比對后，使用MEGA 5.05軟件，通過Neighbor joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，在構建系統(tǒng)發(fā)育樹時進行自舉檢驗，重復抽樣1 000次。

2 結果與分析

2.1 菌株GJMS032的致病性

通過篩選獲得1株對柑橘木虱具有致病力的菌株，命名為 GJMS032。以1.0×109spores·mL－1菌株分生孢子懸浮液處理柑橘木虱后3 d，校正死亡率為38.5%;處理后7 d，校正死亡率達98%。處理后第2天，通過體視顯微鏡，即可在一些蟲體表面觀察到菌絲長出，至7 d后，肉眼可見菌株GJMS032的產(chǎn)孢結構 (圖1)。

圖1 菌株GJMS032對柑橘木虱的侵染

2.2 菌株GJMS032的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

菌株GJMS032在PDA培養(yǎng)基上于25℃恒溫培養(yǎng)7 d，其菌落直徑可達5 cm，具同心環(huán)紋。菌絲體為白色，分生孢子呈赭黃色，質地絲絨狀，具少量無色滲出液，菌落反面為黃褐色。

光學顯微鏡下觀察菌株的分生孢子頭呈球形，分生孢子梗直立，孢梗莖長650～1 600 μm，寬10～15 μm，莖壁粗糙，頂囊球形或近球形，直徑25～45 μm，產(chǎn)孢結構雙層，?；笮?～7 μm×2.5～4 μm，瓶梗大小為8 ～12 μm ×3 ～4 μm;分生孢子為球形或近球形，直徑2.5～3.5 μm(圖2)。

圖2 菌株GJMS032在光學顯微鏡下的形態(tài)特征

2.3 菌株GJMS032的序列分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，通用引物ITS5/ITS4擴增菌株GJMS032的PCR產(chǎn)物大小為610 bp左右。測序后選取其中的ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因區(qū)域，利用NCBI Blast進行在線比對。分析發(fā)現(xiàn)，所測序列與GenBank中Aspergillus westerdijkiae和A．ochraceus多個分離物的序列相似性達98% ～100%。

在系統(tǒng)發(fā)育樹中 (圖3)，菌株GJMS032與A．westerdijkiae，包括模式菌株 NRRL3174(GenBank NO.EF661427)在內的多個分離物及A．ochraceus的幾個分離物聚為1個分支，而A．ochraceus的模式菌株 (GenBank No.AY373856)及其他幾個分離物和曲霉屬其他幾個種的菌株聚為另外1個分支。基于上述關于形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的描述及對ITS1－5.8S rDNA－ITS2 序列的 分析，可 將 菌 株GJMS032初步鑒定為A．westerdijkiae。

圖3 基于ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因構建的菌株GJMS032系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結與討論

目前已報道的對柑橘木虱具有致病作用的真菌有擬青霉屬的宛氏擬青霉 (Paecilomyces varioti)和玫煙色擬青霉 (P．fumosoroseus)、白僵菌屬的球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)、綠僵菌屬的金龜子綠僵菌 (Metarhizium anisopliae)、被毛孢屬的檬形被毛孢 (Hirsutella citriformis)、筍頂孢屬的蚜筍頂孢霉 (Acrostalagmus aphidium)、鐮孢屬的黃色鐮刀菌 (Fusarium culmorum)、輪枝孢屬的蠟蚧輪枝菌 (Lecanicillium lecanii)、枝孢屬的尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)及柑橘煤炱菌(Capnodium citri)、匍柄霉 (Stemphyliumsp.)等［2－3］。對于曲霉屬真菌侵染柑橘木虱的研究報道較少。上世紀80年代，陳祝安等［2］從田間發(fā)病的柑橘木虱蟲體上分離到了日本曲霉 (A．japonica)，但未對其致病性進行驗證。

根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及ITS1－5.8S rDNAITS2序列，可將所分離的菌株GJMS032鑒定為曲霉屬的一種真菌。但其ITS1－5.8S rDNA－ITS2序列與 GenBank中曲霉屬的A．westerdijkiae和A．ochraceus的多個分離物均具有較高的同源性，難以鑒定其具體為哪一個種。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，A．westerdijkiae是近年來從A．ochraceus新分離出來的一個種，原來A．ochraceus的一些分離物現(xiàn)已被重新鑒定為A．westerdijkiae。2個菌種的形態(tài)特征具有高度的相似性，但可通過 ITS1－5.8S rDNA－ITS2和 β－tubulin 基因序列區(qū)分開來［4－8］。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，菌株GJMS032與A．westerdijkiae的模式種聚為一個分支，其中也含有多個A．ochraceus的分離物，推測認為這些A．ochraceus分離物可能未得到重新鑒定更新而沿用了以前的名稱，實際可能是A．westerdijkiae。而A．ochraceus的模式種和其他多個分離物處于另外一個分支中?；谝陨戏治?，將菌株初步鑒定為A．westerdijkiae。

曲霉屬真菌種類繁多，在世界范圍內廣泛分布。其中作為蟲生真菌報道過的種類有A．flavus、A．parasiticus、A．oryzae、A．tamarii、A．ochraceus、A．niger和A．candidus等［9］。如 Kodaira 等［10］從A．ochraceus侵染的家蠶幼蟲的血液中提取的物質注入健康家蠶的體腔中能致死家蠶，從而表明毒素的存在;Robert等［11］研究發(fā)現(xiàn)，A．ochraceus在昆蟲體內可產(chǎn)生赭曲霉素，通過體腔注射美國白蛾可使其麻痹死亡。Vega等［12］發(fā)現(xiàn)，A．westerdijkiae可侵染咖啡果小蠹的寄生蜂Prorops nasuta，并可產(chǎn)生赭曲霉素A。本研究所分離的菌株GJMS032，初步鑒定為A．westerdijkiae，對柑橘木虱具有較強的致病作用。遺憾的是，曲霉屬真菌通常會產(chǎn)生多種對人和動物有害的毒素，如赭曲霉毒素通常對腎有危害及對免疫系統(tǒng)有毒性［13］，因此難以在植物病蟲害的生物防治中推廣應用。

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