表皮生長因子及其受體對結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖調(diào)控*

馮燕君 劉 倩 方 一 宋榮峰 萬以葉劉建勝 王海偉 杜艷芝 張 濟(jì) 夏 璐＆

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科1(200025) 江西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科2中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所基因組學(xué)3

傳統(tǒng)理論認(rèn)為腫瘤是均一的細(xì)胞團(tuán)體，是所有腫瘤細(xì)胞共同增殖的結(jié)果，而腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)假說認(rèn)為腫瘤為一異質(zhì)體，其中存在一小部分干細(xì)胞特性的腫瘤干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化以及高度增殖能力，是腫瘤生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥的根源［1］。目前，已在急性髓細(xì)胞樣白血病、乳腺癌、頭頸部癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中分離、鑒定出 CSCs［2～6］。腫瘤細(xì)胞生長需特定微環(huán)境，細(xì)胞因子在其中發(fā)揮重要作用。腸道干細(xì)胞在增殖過程中，可通過分泌生長因子如表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，維持自身生長并抑制凋亡［7，8］。已知 EGF對 CSCs生長具有一定調(diào)控作用，Soeda等［9］的研究顯示，EGF可促進(jìn)腦CSCs增殖。然而，關(guān)于EGF對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響尚未見報(bào)道。本研究通過探討EGF及其受體(EGFR)在結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用，以期為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所基因?qū)嶒?yàn)室保存);健康清潔級(jí)雄性BALB/c(nu/nu)小鼠6只(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)。RPMI1640、DMEM/F12、4%BSA、0.05%EDTA-胰酶、Trizol試劑(Gibco公司);B27、胰島素樣生長因子(IGF)、MTT、DMSO(Sigma公司);EGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(PeproTech公司);吉非替尼(Tocris Bioscience公司);PD153035(Merck公司);Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒(BD公司);鼠抗兔Ki67單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司);Real-Time PCR試劑盒(Qiagen公司)。

二、方法

1.細(xì)胞株和細(xì)胞球培養(yǎng):結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×103/mL接種于由 DMEM/F12(1∶1)、B27(1∶50)、4%BSA(1∶10)、EGF(20 ng/mL)、bFGF(20 ng/mL)組成的無血清培養(yǎng)基(SFM)中培養(yǎng)。

2.生長因子干預(yù)細(xì)胞:取HT29、HCT116細(xì)胞在SFM中形成的細(xì)胞球，以0.05%EDTA-胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以1×103/mL接種于96孔板，分別以20 ng/mL EGF、bFGF、IGF 干預(yù)，同時(shí)設(shè)立空白對照組。5～7 d后顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞球數(shù)。

3.MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制:取HCT116細(xì)胞球，制成單細(xì)胞懸液，以1×106/mL接種于96孔板，分別加入不同濃度(0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L)EGFR抑制劑吉非替尼，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)72 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，棄MTT溶液，加入DMSO 20 μL溶解紫色結(jié)晶，以酶標(biāo)儀行分光光度檢測，于570 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，繪制生長曲線并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

4.體外增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞球形成抑制:取HCT116細(xì)胞球，制成單細(xì)胞懸液，以1×103/mL接種于96 孔板，分別加入不同濃度(0、1、5、10、15、20 μmol/L)吉非替尼，另一96孔板加入EGFR抑制劑PD153035(濃度同吉非替尼)，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)72 h，顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞球數(shù)。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:取HCT116細(xì)胞球，制成單細(xì)胞懸液，分別加入不同濃度(0、1、5、10、15 μmol/L)吉非替尼，培養(yǎng) 72 h，加入 Annexin V-FITC和PI染色液，混勻后室溫避光靜置15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

6.小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成瘤能力:取HCT116細(xì)胞球和RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長的HCT116細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，小鼠右側(cè)腋窩皮下接種由細(xì)胞球制成的單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)，同只小鼠左側(cè)腋窩皮下接種由細(xì)胞株制成的單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)，觀察小鼠兩側(cè)成瘤率以及皮下移植瘤生長速度，瘤體直徑≥5 mm起開始測量移植瘤體積，體積=長徑×短徑2/2，繪制移植瘤生長曲線。

取小鼠皮下移植瘤行HE染色、免疫組化SABC法染色。腫瘤組織石蠟包埋、切片，脫蠟至水，以3%H2O2室溫孵育，5%山羊血清封閉，室溫孵育，加入鼠抗兔Ki67單克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，PBS沖洗，加入生物素標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，加入HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素(1∶10 000)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB或AEC顯色，自來水沖洗，復(fù)染，封片，攝片。

7.Real-time PCR:參考 Barker 等［10］、Kayahara等［11］、Chan 等［12］的研究，檢測干細(xì)胞標(biāo)記 LGR5、Musashi-1和分化標(biāo)記CK20在HCT116細(xì)胞球和細(xì)胞株中的表達(dá)。取 HCT116細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞，Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。LGR5引物上游:5’-CTC CCA GGT CTG GTG TGT TG-3’，下游:5’-GTG AAG ACG CTG AGG TTG GA-3’;Musashi-1引物上游:5’-GGA CTC AGT TGG CAG ACT ACG-3’，下游:5’-CTG GTC CAT GAA AGT GAC GAA-3’;CK20引物上游:5’-ATG GAT TTC AGT CGC AGA AGC-3’，下游:5’-CTC CCA TAG TTC ACC GTG TGT-3’;GAPDH 引物上游:5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’，下游:5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’。參照Real-Time PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系總體系10 μL，反應(yīng)條件:95℃ 60 s;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃45 s，共 40 個(gè)循環(huán);最后 72 ℃ 延伸 5 min。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、生長因子對結(jié)腸癌細(xì)胞球形成的影響

在無血清培養(yǎng)基中，HCT116、HT29細(xì)胞均能形成細(xì)胞球(見圖1A、1B)。HCT116細(xì)胞球數(shù)量在空白對照組、EGF組、bFGF組、IGF組分別為(25.30±2.14)/孔、(41.78 ± 2.75)/孔、(26.33 ± 1.66)/孔、(27.22 ±2.66)/孔，EGF 組較其余各組顯著升高(P＜0.05)(見圖1C)。HT29細(xì)胞球數(shù)量在四組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見圖1D)。

二、EGFR抑制劑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞球細(xì)胞增殖

MTT 法檢測結(jié)果顯示，不同濃度(0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L)吉非替尼作用于 HCT116 細(xì)胞球細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受抑，增殖率隨藥物濃度增加而降低，濃度達(dá)1 μmol/L后，增殖抑制尤為明顯(見圖2)。IC50值為(12.5 ±0.48)μmol/L。

圖1 生長因子對結(jié)腸癌細(xì)胞球形成的影響

圖2 吉非替尼抑制HCT116細(xì)胞球細(xì)胞增殖

三、EGFR抑制劑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞球形成

體外增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉非替尼對HCT116細(xì)胞球形成具有抑制作用，作用隨藥物濃度增加而增強(qiáng)，濃度為15 μmol/L時(shí)抑制效應(yīng)最大(見圖3A)。PD153035的抑制作用與吉非替尼相似，濃度為20 μmol/L時(shí)抑制效應(yīng)最大(見圖3B)。

四、EGFR抑制劑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞球細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，不同濃度(0、1、5、10、15 μmol/L)吉非替尼作用于 HCT116細(xì)胞球細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加而增加，1 μmol/L與15 μmol/L組間差異顯著(P ＜0.05)(見圖4)。

圖3 EGFR抑制劑抑制HCT116細(xì)胞球形成

圖4 吉非替尼誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞球細(xì)胞凋亡

五、結(jié)腸癌細(xì)胞球和細(xì)胞株體內(nèi)成瘤能力

小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCT116細(xì)胞球成瘤時(shí)間較HCT116細(xì)胞株顯著縮短，接種18 d后，細(xì)胞球成瘤體積顯著大于細(xì)胞株(P＜0.05)(見圖5)。

HCT116細(xì)胞球和細(xì)胞株移植瘤HE染色、免疫組化染色結(jié)果顯示，兩種移植瘤的腫瘤細(xì)胞排列、核異型性和Ki67表達(dá)無明顯差異(見圖6)。

圖5 HCT116細(xì)胞球和細(xì)胞株體內(nèi)成瘤能力比較

六、結(jié)腸癌細(xì)胞球和細(xì)胞株干細(xì)胞標(biāo)記、分化標(biāo)記表達(dá)

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，干細(xì)胞標(biāo)記LGR5、Musashi-1在HCT116細(xì)胞球中的表達(dá)顯著高于HCT116細(xì)胞株，而分化標(biāo)記CK20在細(xì)胞株中的表達(dá)顯著高于細(xì)胞球(P＜0.05)(見圖7)。

圖6 HCT116細(xì)胞球和細(xì)胞株移植瘤HE染色和免疫組化染色

圖7 HCT116細(xì)胞球和細(xì)胞株干細(xì)胞標(biāo)記、分化標(biāo)記表達(dá)比較

討 論

既往對于腫瘤來源的研究多集中于癌細(xì)胞基因突變或表達(dá)異常，但腫瘤基因具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性、時(shí)間、空間依賴性以及個(gè)體差異性等特點(diǎn)，尋找具有腫瘤共性和特異性的基因難度較大。隨著科學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在增殖、分化方面與干細(xì)胞極為相似，提出腫瘤可能是一種干細(xì)胞疾病的理論［13］。

CSCs、腫瘤前體細(xì)胞和分化的腫瘤細(xì)胞是一個(gè)處于動(dòng)態(tài)平衡的共存體。目前無血清培養(yǎng)法是經(jīng)典的體外富集CSCs的方法，無血清環(huán)境能有效抑制細(xì)胞分化，使腫瘤細(xì)胞維持于CSCs狀態(tài)。CSCs的“干”性主要表現(xiàn)為表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子、啟動(dòng)腫瘤發(fā)生和參與腫瘤形成，即致瘤性。致瘤性的鑒定主要通過將細(xì)胞接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察一定時(shí)間內(nèi)其在小鼠體內(nèi)形成移植瘤的情況，此方法是鑒別CSCs的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCT116細(xì)胞球在體內(nèi)形成移植瘤的能力明顯強(qiáng)于HCT116細(xì)胞株。進(jìn)一步對兩種細(xì)胞形成的移植瘤進(jìn)行HE染色和免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)兩種移植瘤的腫瘤細(xì)胞排列、核異型性和Ki67表達(dá)無明顯差異，提示HCT116細(xì)胞球和細(xì)胞株形成的移植瘤均來源于HCT116干細(xì)胞。細(xì)胞球形成的移植瘤體積顯著大于細(xì)胞株，說明細(xì)胞株的結(jié)腸癌干細(xì)胞數(shù)量少于細(xì)胞球。此外，干細(xì)胞標(biāo)記鑒定結(jié)果顯示，HCT116細(xì)胞球中的LGR5、Musashi-1表達(dá)水平顯著高于HCT116細(xì)胞株，故推測無血清培養(yǎng)獲得的腫瘤細(xì)胞球是CSCs的聚集體。

EGF是一種作用十分廣泛的生長因子，通過與EGFR結(jié)合而發(fā)揮作用。研究［7］顯示EGF等生長因子能促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖，抑制腸道祖細(xì)胞凋亡。在CSCs的培養(yǎng)中，EGF、bFGF等生長因子已作為常規(guī)物質(zhì)添加至培養(yǎng)基中。對頭頸部癌、前列腺癌的研究［14，15］證實(shí)，EGF、EGFR 在調(diào)節(jié) CSCs 增殖過程中發(fā)揮重要作用。

EGFR是細(xì)胞表面ErbB受體家族中的一員，參與細(xì)胞增殖、生長、遷移、浸潤等過程。研究［16］發(fā)現(xiàn)EGFR能通過唾液酸化作用調(diào)節(jié)EGF介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以及對吉非替尼的耐藥性。本研究結(jié)果顯示EGF對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用;證實(shí)EGF參與了結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖調(diào)控。進(jìn)一步采用EGFR抑制劑吉非替尼、PD153035處理無血清培養(yǎng)條件下形成的HCT116細(xì)胞球，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者對細(xì)胞球形成具有明顯抑制作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)EGFR抑制劑系通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮增殖調(diào)控作用。Bae等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR抑制劑可通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)UL16結(jié)合蛋白1(ULBP1)，增強(qiáng)其對自然殺傷(NK)細(xì)胞的敏感性。本研究結(jié)果顯示，EGFR抑制劑對HCT116細(xì)胞球的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用可能與調(diào)節(jié)LGR5、Musashi-1和CK20表達(dá)有關(guān)。Zvibel等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)于肝細(xì)胞外基質(zhì)(hECM)中的具有高轉(zhuǎn)移能力的結(jié)腸癌細(xì)胞，其干細(xì)胞標(biāo)記LGR5表達(dá)顯著升高。Walker等［19］的研究顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞敲除LGR5基因后，其克隆增殖、侵襲以及成瘤能力顯著降低。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)EGF對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29形成細(xì)胞球具有促進(jìn)作用;EGFR抑制劑可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞球增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相關(guān)作用可能與調(diào)控干細(xì)胞標(biāo)記LGR5、Musashi-1和分化標(biāo)記CK20表達(dá)有關(guān)。對結(jié)腸癌干細(xì)胞有待作更深入的研究，以明確其生物學(xué)功能，為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

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