系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者治療后外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞活化因子和受體表達(dá)變化的研究

劉小軍 茹晉麗 李小峰 張少然

1河南省新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕科，河南新鄉(xiāng) 453000；2.解放軍第二六四醫(yī)院風(fēng)濕科，山西太原 030000；3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，山西太原 030001；4.山西省醫(yī)學(xué)會(huì)，山西太原 030000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者治療后外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞活化因子和受體表達(dá)變化的研究

劉小軍1茹晉麗2李小峰3張少然4

1河南省新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕科，河南新鄉(xiāng) 453000；2.解放軍第二六四醫(yī)院風(fēng)濕科，山西太原 030000；3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，山西太原 030001；4.山西省醫(yī)學(xué)會(huì)，山西太原 030000

目的 對(duì)比治療前后系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （SLE）患者外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞 （PBMCs）B淋巴細(xì)胞活化因子（BAFF）和B淋巴細(xì)胞活化因子受體（BAFF-R）mRNA表達(dá)水平的變化。 方法 收集SLE初發(fā)患者14例，所有患者SLEDAI評(píng)分均大于10分，分別于治療前和治療后12周收集血液標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)SLE患者外周血PBMCs BAFF和BAFF-R mRNA表達(dá)水平。同時(shí)，納入10例健康者進(jìn)行對(duì)照。 結(jié)果 治療后14例SLE患者SLEDAI評(píng)分均低于10分，病情穩(wěn)定，SLE患者組治療前、治療后12周PBMC BAFF和BAFF-R mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）。患者組治療后12周與治療前相比PBMC BAFF和BAFF-R mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。 結(jié)論 SLE患者PBMCs BAFF和BAFF-R mRNA表達(dá)水平隨病情好轉(zhuǎn)而下降，可以作為疾病活動(dòng)性指標(biāo)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；B淋巴細(xì)胞活化因子；B淋巴細(xì)胞活化因子受體；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多臟器的自身免疫性疾病，存在B淋巴細(xì)胞過度活化。B淋巴細(xì)胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（TNF）家族的新成員，主要作用是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的功能。新近發(fā)現(xiàn)的BAFF第三種受體BAFF-R，是BAFF的特異性受體，兩者結(jié)合后，參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)。本課題研究SLE患者治療前后BAFF與BAFF-R的表達(dá)，探討B(tài)AFF與BAFF-R在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用和意義，為SLE的病情發(fā)生、發(fā)展及治療后評(píng)估提供新的思路和評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年1～10月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和解放軍二六四醫(yī)院風(fēng)濕科住院SLE患者14例，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)；其中，男性1例，女性 13 例，年齡 18～44 歲，平均（32.05±12.42）歲。 有慢性感染病史、惡性腫瘤、高血壓、糖尿病及嚴(yán)重的心腦血管疾病者除外。治療采用醋酸潑尼松 （1～2 mg/kg），環(huán)磷酰胺（800～1000 mg，3～4 周應(yīng)用 1 次）。 正常對(duì)照組 10 例，年齡20～41 歲，平均（28.76±7.29）歲。 所有入組患者 SLEDAI評(píng)分均大于10分，經(jīng)治療后14例患者均病情穩(wěn)定 （以SLEDAI評(píng)分低于10分為病情穩(wěn)定）。

在治療前、治療后12周觀察SLEDAI評(píng)分變化，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）BAFF 和 BAFF-R mRNA表達(dá)水平。

1.2 主要試劑與儀器

B320A型醫(yī)用低速離心機(jī)（白洋離心機(jī)廠），人淋巴細(xì)胞分離液 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程科學(xué)研究所），Trizol（TaKaRa公司），氯仿（北京化工廠），異丙醇（北京化工廠）， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TaKaRa公司），PCR試劑盒（TaKaRa公司）。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的提?。撼槿LE患者及健康對(duì)照組靜脈血各10 ml，加淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心法常規(guī)分離PBMC，細(xì)胞計(jì)數(shù)至少達(dá)到 5.0×106個(gè)/ml。

1.3.2 RNA 的提取：細(xì)胞中加入 750 μl RNAiso plus，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心5 min，上清移至新的離心管，加入1/5RNAiso plus體積量的氯仿，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心15 min，上清移至新的離心管，加入等體積量的異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，棄上清保留沉淀，溶于20 μl DEPC處理水中。

1.3.3 根據(jù) Genbank人 BAFF mRNA序列 （AF132600），利用PCGENE軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 BAFF引物序列

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：加入 5×PrimeScriptBRBuffer 4 μl，Prime-ScriptBRRT Enzyme MixⅠ1 μl，Oligo Dt Primer 1 μl，Random 6 mers 1 μl，Total RNA 5 μl，DEPC 處理水 8 μl。 37℃15 min，85℃ 5 s。加入總RNA的提取與 cDNA的合成，PCR擴(kuò)增依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包處理數(shù)據(jù)，所有正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以四分位間距表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)/單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

14 例SLE患者治療前、治療后12周PBMC BAFF mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）。14例SLE患者治療后12周與治療前相比PBMC BAFF mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）（表 2）。

14 例SLE患者治療前、治療后12周PBMC BAFF-R mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）。14例SLE患者治療后12周與治療前相比PBMC BAFF-R mRNA 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）（表 2）。

表2 PBMC BAFF mRNA表達(dá)的水平

3 討論

SLE是以B淋巴細(xì)胞異常增殖為主的一組自身免疫性疾病，異常B細(xì)胞在SLE發(fā)病中起到主要作用[1]。BAFF是腫瘤壞死因子家族新成員，是B淋巴細(xì)胞生長、發(fā)育和分化中重要的免疫調(diào)控因子。BAFF是近年來各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)。病理狀態(tài)下，BAFF過度表達(dá)可能參與了自身反應(yīng)性B細(xì)胞的產(chǎn)生和自身免疫耐受的失衡，導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生[2]。BAFF-R是BAFF的特異性受體，BAFF主要通過與BAFF-R的結(jié)合對(duì)B細(xì)胞的發(fā)育、功能及內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3]。然而過量的BAFF又會(huì)導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞過度活化而引起某些自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE）。

本研究中治療前SLE患者BAFF mRNA水平較正常對(duì)照顯著升高，治療后BAFF mRNA水平較治療前顯著下降，這與以往報(bào)道相似[2-4]，提示BAFF可能參與了SLE的發(fā)病，可能BAFF與疾病活動(dòng)相關(guān)。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMCs中BAFF的表達(dá)與SLE的活動(dòng)性指標(biāo)呈正相關(guān)，與高免疫球蛋白IgG、IgM血癥呈正相關(guān)，與補(bǔ)體C3、C4水平呈負(fù)相關(guān)[5]。說明BAFF是SLE發(fā)病的重要調(diào)控因子，其在PBMCs中表達(dá)的升高在一定程度上反映了SLE病情的活動(dòng)。

BAFF有三種受體，BAFF-R是BAFF的特異性受體[6]。為此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中BAFF及其受體BAFF-R的表達(dá)，以進(jìn)一步探討B(tài)AFF及BAFF-R在SLE中的變化和意義。本研究中BAFF與BAFF-R結(jié)果一致，治療前SLE患者BAFF-R mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯升高，病情穩(wěn)定后顯著下降，提示BAFF-R可能參與發(fā)病，并且也可能與病情活動(dòng)有關(guān)。

而BAFF/BAFF-R途徑可能是參與SLE發(fā)病機(jī)制的主要途徑，BAFF、BAFF-R可以作為疾病活動(dòng)性指標(biāo)。治療后BAFF/BAFF-R表達(dá)水平明顯下降，如果設(shè)法阻斷BAFF/BAFF-R的生物活性，可能起到治療SLE的作用[7]。國內(nèi)丁涵露等[8]研究發(fā)現(xiàn)在BXSB狼瘡鼠腹腔注射B淋巴細(xì)胞因子融合蛋白5周后發(fā)現(xiàn)，外周血BAFF水平下降，抗dsDNA抗體有部分下降，尿蛋白減少，腎臟病理損傷減輕，提示抑制體內(nèi)BAFF水平可能對(duì)治療SLE有效。因此抗BAFF、BAFF-R抗體和用它們的受體融合蛋白封閉BAFF、BAFF-R，使B淋巴細(xì)胞活化受抑，能為SLE提供新型藥物。

[1]Nardelli B，Belvedere O，Roschke V，et al.Synthesis and release of B lymphocyt stimulator form myeloid cells[J].Blood，2001，97（1）：198-204.

[2]Stohl W，Metyas S，Tan SM，et al.B lymphocyte stimulator overexpression in patients with systemic lupus erythematosus：longitudinal observations[J].Arthritis Rheum，2003，48（12）：3475-3486.

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[5]何志翔，蔡小燕，林小軍，等.B淋巴細(xì)胞刺激因子及其受體BAFF-R在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].中國綜合臨床，2008，24（11）：1075-1077.

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[8]丁涵露，王莉，倪兵，等.B淋巴細(xì)胞因子融合蛋白改善BXSB狼瘡鼠病變的研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)，2010，14（12）：228-231.

Research on B Cell activating factor and receptor expression changes from peripheral blood mononuclear cell after systemic lupus erythematosus treatment

LIU Xiao-jun1RU Jin-li2LI Xiao-feng3ZHANG Shao-ran4

1.Department of Rheumatism,The First People′s Hospital of Xinxiang City in Henan Province,Xinxiang 453000,China;2.Department of Rheumatism,The 264thHospital of Chinese People′s Liberation Army,Taiyun 030000,China;3.Department of Rheumatism,the second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;4.Shanxi Medical Association,Taiyuan 030000,China

ObjectiveTo compare m RNA expression of B cell activating factor(BAFF)and receptor(BAFF-R)expression changes from peripheral blood mononuclear cell between before and after systemic lupus erythematosus(SLE)treatment.Methods14 new diagnosed patients with SLE were selected and all scores of these patients were above 10.The blood samples were selected before treatment and at 12 weeks after treatment respectively.mRNA expression of BAFF and BAFF-R expression from peripheral blood mononuclear cell was measured by real time PCR(RT-PCR).10 healthy volunteers were selected for control.ResultsAll scores of these patients were below 10 after treatment and the disease conditions were stable.Both of mRNA expression of BAFF and BAFF-R expression from patients before and after treatment were significantly higher than those from the control group(P<0.05).And mRNA expression of BAFF and BAFF-R expression from patients after treatment were significantly lower than those from patients before treatment(P<0.05).ConclusionMRNA expression of BAFF and BAFF-R expression of peripheral blood mononuclear cell from SLE patients can reduce accompanying by disease improvement,and can be used for biomarkers of disease activity.

Systemic lupus erythematosus;B cell activating factor;B cell activating receptor;Real time PCR

R593.24

A

1674-4721（2013）08(c)-0043-03

2013-04-22 本文編輯：魏玉坡）