實(shí)時(shí)熒光P C R在人乳頭瘤病毒臨床檢測(cè)中的應(yīng)用

胥 文

山東省萊蕪鋼鐵集團(tuán)有限公司醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東萊蕪 271126

大量的臨床研究報(bào)道證實(shí)人乳頭瘤病毒（HPV）是導(dǎo)致女性宮頸癌和癌前病變的主要病毒，調(diào)查顯示宮頸癌患者的標(biāo)本HPV檢出率已經(jīng)超過(guò)了90%，因此做好人乳頭瘤病毒的檢查診斷對(duì)宮頸疾病的預(yù)防和治療有著極其重要的臨床價(jià)值[1]。國(guó)際癌癥組織對(duì)世界多個(gè)國(guó)家地區(qū)的宮頸癌進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)該類病毒主要有15種高危型DNA，HPV16、HPV18和HPV58是我國(guó)最為常見的三種高危型病毒[2]。目前第二代雜交捕獲法是檢測(cè)HPV的主要方法，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的出現(xiàn)為DNA的臨床檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便和快捷。本次研究主要對(duì)第二代雜交捕獲法和實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較分析，以期為臨床診斷HPV提供參考，現(xiàn)總結(jié)如下：

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2010年10月～2011年10月于本院婦產(chǎn)科接受診治的人乳頭瘤病毒感染患者102例，年齡24～60歲，平均（34.8±2.6）歲；臨床細(xì)胞檢查結(jié)果：低度鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)病變患者40例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變患者16例，不典型鱗狀細(xì)胞46例；所有患者均無(wú)其他嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)疾病，本次檢查已征得患者的同意。

1.2 試劑和儀器

本次試驗(yàn)所用的主要試劑盒器材如下：美國(guó)Digene公司提供HPV-DNA試劑盒、HCⅡ基因雜交信號(hào)擴(kuò)大系、子宮頸采樣器，Xygen公司提供的微孔板封面膠膜和圓底96孔酶標(biāo)板；上海復(fù)星診斷公司提供的高危型HPV實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)時(shí)熒光PCR儀（Line-Gene FQIN33 A型）。

1.3 試驗(yàn)方法

采取對(duì)照性試驗(yàn)進(jìn)行分析探討，分別使用第二代雜交捕獲法（HCⅡ）和實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)102例患者的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合患者的病理資料對(duì)兩種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 第二代雜交捕獲檢測(cè) 本方法可對(duì)13種高危型HPV進(jìn)行同步檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)操作，首先是對(duì)標(biāo)本DNA解鏈，將解鏈后的單鏈DNA與RNA探針雜交，得到DNA-RNA的雜交體，雜交體可同微孔壁特異性抗體進(jìn)行結(jié)合，磷酸化抗體后信號(hào)放大，底物經(jīng)堿性磷酸酶作用后發(fā)光，通過(guò)發(fā)光的強(qiáng)弱來(lái)對(duì)微孔壁上磷酸酶含量進(jìn)行測(cè)定，最后獲得特異性結(jié)合雜交體含量。如果HPV負(fù)荷量超過(guò)1.0 pg/mL則可判定為發(fā)生 HPV陽(yáng)性感染。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 不同探針和引物（3'端和5'端分別標(biāo)有熒光淬滅基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)）需要在特異性堿基區(qū)和模板作用，Taq酶能夠?qū)⑻结樈到猓藭r(shí)熒光報(bào)告基團(tuán)可以擺脫熒光淬滅基團(tuán)，增強(qiáng)熒光信號(hào)，通過(guò)定量PCR儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)標(biāo)本熒光信號(hào)，確定其型別。實(shí)時(shí)熒光PCR劑盒也可對(duì)13種高危型HPV型進(jìn)行檢測(cè)，其操作流程主要根據(jù)試劑盒說(shuō)明書實(shí)施，大概步驟：樣本DNA的提取-實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液的配置-樣本實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和檢測(cè)-根據(jù)熒光值判定反應(yīng)結(jié)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度宮頸病變的HPV陽(yáng)性檢出率

病理資料顯示本組病例中宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）的有38例，慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的36例，HCⅡ和實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)CIN的HPV陽(yáng)性檢出率分別為86.84%和94.74%，對(duì)慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的陽(yáng)性檢出率分別為36.11%和58.33%，具體比較情況見表1。

表1 兩種方法不同程度宮頸病變的HPV陽(yáng)性檢出率比較[n（%）]

2.2 HPV的陽(yáng)性檢出率和符合率

HCⅡ的HPV總陽(yáng)性檢出率為62.75%，實(shí)時(shí)熒光PCR的為71.57%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.46，P＜0.05），兩種方法的總符合率為82.35%，具體比較情況見表2。

表2 兩種方法的陽(yáng)性檢出率比較

2.3 CIN的臨床檢測(cè)

根據(jù)患者的病理檢查結(jié)果對(duì)CINⅡ和CINⅢ的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩種手段在高危型宮頸病變的檢測(cè)具有較好的相關(guān)性，實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏性和特異性要略好于HCⅡ。

3 討論

3.1 人乳頭瘤病毒

目前的臨床研究[3-4]發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒基因型有100余種，和生殖道感染相關(guān)的占到了40%，和腫瘤發(fā)生相關(guān)的占了20%，根據(jù)其致病能力的異同可將該類病毒分為高危型病毒和低危型病毒，該病毒和女性宮頸癌的發(fā)生有著極為密切的關(guān)系。低危型病毒可能導(dǎo)致濕疣和宮頸上皮內(nèi)發(fā)熱低度病變，高危型人乳頭瘤病毒具有較高的致癌能力，主要包括HPV16、HPV18，已有的一些研究已經(jīng)證實(shí)宮頸癌組織標(biāo)本該類病毒的陽(yáng)性檢出率超過(guò)90%，因此做好其診斷檢查對(duì)臨床治療具有重要的意義[5]。

3.2 兩種檢測(cè)方法

臨床研究[6-7]證實(shí)第二代雜交捕獲檢測(cè)對(duì)HPV具有較好的臨床檢測(cè)效果，隨著醫(yī)療診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床檢測(cè)。本研究對(duì)第二代雜交捕獲檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，兩者的符合性達(dá)到82.35%，結(jié)果證明兩種手段在高危型宮頸病變的檢測(cè)具有較好的相關(guān)性；實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏性和特異性要略好于第二代雜交捕獲檢測(cè)，本次研究結(jié)果中實(shí)時(shí)熒光PCR總陽(yáng)性檢出率也要顯著好于第二代雜交捕獲檢測(cè)，且對(duì)慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的HPV的檢測(cè)效率要顯著好于第二代雜交捕獲檢測(cè)，這些結(jié)果說(shuō)明此種檢測(cè)方法對(duì)于臨床檢測(cè)和診斷HPV具有較好的效果，可以作為一種有效的檢測(cè)手段來(lái)對(duì)此種病毒診斷，實(shí)時(shí)熒光PCR的操作簡(jiǎn)便有效，在縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)，大大提高了對(duì)人乳頭瘤病毒的診斷的有效性[8]。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR和第二代雜交捕獲法都是臨床上檢測(cè)人乳頭瘤病毒的有效方法，兩者的HPV診斷相關(guān)性較高，實(shí)時(shí)熒光PCR具有較好的靈敏性和特異性，提高了診斷準(zhǔn)確性，為宮頸類疾病的早發(fā)現(xiàn)和治療提供了可靠的依據(jù)。

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