梓醇對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

畢方杰，張虎，胡健

（1.山東省淄博市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 淄博 255000；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154000；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110001）

近年來，心血管疾病的發(fā)病率和致殘致死率在全世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，雖然藥物治療與介入治療是目前主要治療手段，但均存在一定不足。因此篩選新的抗心肌缺血藥物和探索抗心肌缺血機(jī)制仍是一項(xiàng)重要的研究課題。梓醇作為地黃中的主要有效成份，屬于環(huán)烯醚萜單糖類。研究表明梓醇具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)。目前研究主要集中在梓醇抗腦細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，梓醇在細(xì)胞水平對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞也有保護(hù)作用［1］，另有研究表明梓醇可明顯改善心功能不全。因此我們有理由進(jìn)一步研究梓醇的心肌保護(hù)作用，從而為進(jìn)一步研發(fā)新的有效治療心血管疾病的天然藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型：

健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)提供方法制作心肌損傷模型［1］，采用異丙腎上腺素（每次85 mg/kg）連續(xù)皮下注射2次（間隔24 h）的方法成功建立心肌損傷模型。

1.2 材料及試劑

梓醇及丹參酮ⅡA均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，異丙腎上腺素購(gòu)于Sigma公司，CK-MB及LDH試劑盒購(gòu)于南京建成生物制品公司，所有一抗及二抗均購(gòu)于Santa Cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將48只Wistar大鼠分為6組，每組8只，分別是：（1）正常對(duì)照組（Control組）；（2）模型組（Model組）；（3）陽性對(duì)照組（TanshinoneⅡA 組）；（4）低劑量梓醇組（Catalpol-L 組 2.5 mg/kg）；（5）中劑量梓醇組（Catalpol-M 組 5 mg/kg）；（6） 高 劑 量 梓 醇 組（Catalpol-H 組 10mg/kg），梓醇劑量參照相關(guān)文獻(xiàn)［2］。所有治療組均用藥10 d，第9 d，10 d連續(xù)在用藥0.5 h后皮下給予異丙腎上腺素（每次85 mg/kg）。

1.4 心肌組織標(biāo)本的留取及檢測(cè)

最后1次用藥結(jié)束24 h后，麻醉后頸動(dòng)脈取血，分離血清后，保存于冰箱內(nèi)，24 h內(nèi)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)CK-MB及LDH的含量。取血后立即處死大鼠取出心臟，沿冠狀溝走行分離左心室心肌，每組取4個(gè)標(biāo)本置于10%中性甲醛中固定24 h，石蠟包埋行HE染色，損傷分級(jí)及免疫組化檢測(cè)。

1.5 HE染色

將固定好的心肌組織常規(guī)石蠟包埋，Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度約5 μm，HE程序染色，Olympus顯微鏡觀察病理改變。

1.6 免疫組化

按博士德公司SABC免疫組化染色試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，用0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù)，DAB顯色液顯色，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。TNF-α和IL-1β陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有黃色或棕黃顆粒沉積，陰性對(duì)照沒有黃色顆粒沉積。在400倍高倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)無重疊圖像，應(yīng)用NIS Elements F2.30圖像采集軟件進(jìn)行圖像采集，Image pro-plus圖像分析軟件計(jì)算平均光密度（mean optical density，MOD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對(duì)各組大鼠生化指標(biāo)的影響

我們首先檢測(cè)反映心肌損傷的血清CK-MB及LDH變化，結(jié)果顯示：Model組明顯高于Control組（P<0.01）。不同劑量梓醇［（2.5～10）mg/kg］預(yù)處理后，血清LDH及CK-MB的活性下降（P<0.01），提示catalpol對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌損傷有保護(hù)作用。見表1。

表1 各組大鼠血清CK-MB和LDH的表達(dá)（±s）Tab.1 ExpressionsofserumCK-MBandLDHinallgroups（±s）

表1 各組大鼠血清CK-MB和LDH的表達(dá)（±s）Tab.1 ExpressionsofserumCK-MBandLDHinallgroups（±s）

1）P<0.01 vs control group；2）P<0.01 vs model group.

Group CK-MB（U/L） LDH（U/L）Control group 55.23±6.28 260.41±20.01 Model group 156.74±13.901） 669.77±28.941）TanshinoneⅡA group 78.50±4.811），2） 449.85±25.381），2）Catalpol（L）group160.65±10.451）623.45±33.101），2）Catalpol（M）group130.79±12.301），2）456.40±32.041），2）Catalpol（H）group81.13±9.211），2）403.00±29.191），2）

2.2 梓醇對(duì)各組大鼠心肌病理改變的影響

結(jié)果顯示：Control組：心肌細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，居細(xì)胞中央，心肌間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無壞死灶。Model組：有明顯的心肌缺血壞死變化，心肌細(xì)胞出現(xiàn)片狀、局灶性壞死，部分心肌保持正常。心肌細(xì)胞核變形、聚集、排列紊亂，心肌間質(zhì)增寬并部分出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維多處腫脹斷裂，肌橫紋消失，局部可見空泡樣變性。TanshinoneⅡA組及3種劑量Catalpol組：部分心肌缺血壞死變化，壞死灶呈點(diǎn)狀，小片狀分布，心肌間質(zhì)部分仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌病理改變程度和面積較模型組要小，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，見圖1。

2.3 各組大鼠心肌損傷分級(jí)

根據(jù)Rona提供的心肌損傷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將各組大鼠心肌分為Grade 0-GradeⅣ5個(gè)級(jí)別。結(jié)果顯示：Catalpol（L）組及Catalpol（M）組心肌損傷程度均較Model組減輕，但是Catalpol（H）組心肌損傷程度減輕最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組心肌病理損傷分級(jí)Tab.2 The pathological grades of myocardium

2.4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠心肌TNF-α蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示TNF-α蛋白陽性染色信號(hào)呈黃色，主要位于心肌細(xì)胞胞漿，Control組有少量表達(dá)，Model組較Control組明顯增多（P<0.01）。與Model組比較，TanshinoneⅡA 組、Catalpol（L） 組、Catalpol（M）組和Catalpol（H）組TNF-α蛋白表達(dá)減少（P<0.01）。見圖 2。

2.5 免疫組化檢測(cè)各組大鼠心肌IL-1β蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示IL-1β蛋白陽性染色信號(hào)呈棕黃色，主要位于心肌細(xì)胞胞漿，與Control組比較，Model組表達(dá)明顯增多（P<0.01），見圖 3。經(jīng)catalpol預(yù)干預(yù)后，IL-1β蛋白表達(dá)減少（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以Catalpol（H）組最顯著。

3 討論

梓醇屬于環(huán)烯醚萜單糖類，是地黃中起主要藥理作用的單體。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)梓醇具有抗凋亡［3，4］、降糖［5］、抗炎［6，7］、抗氧化應(yīng)激［8，9］等多種生物學(xué)活性，其中梓醇對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用研究最為廣泛。目前梓醇對(duì)于心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用的研究處于起步階段，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)：梓醇通過抗氧化對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損害有明顯的保護(hù)作用［1］。在本實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)一步研究梓醇的心肌保護(hù)作用，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

異丙腎上腺素是一種β受體激動(dòng)劑，大劑量皮下注射可引起明顯的心肌損傷［1，2］，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心肌損傷的藥物試驗(yàn)中。雖然其致心肌損傷的作用機(jī)制尚未完全明了，但是相關(guān)研究提示：氧化應(yīng)激［10］、炎癥反應(yīng)［11］及細(xì)胞凋亡［12］可能是主要原因。LDH是一種糖酵解酶，在全身各器官均有分布，LDH質(zhì)與量的改變，直接影響機(jī)體的能量代謝，在心肌細(xì)胞中分布尤其豐富，正常情況下，此酶不會(huì)從細(xì)胞中釋放，但是當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，LDH大量釋放入血，因此血液中LDH的變化是反應(yīng)心肌受損的一項(xiàng)重要指標(biāo)。CK-MB是CK的一種同工酶，主要存在于心肌細(xì)胞的胞漿和線粒體中，它能催化肌酸和ATP之間高能磷酸鍵轉(zhuǎn)換生成磷酸肌酸和ADP的可逆反應(yīng)，為肌肉收縮提供能量。由于CK-MB特異性較高，故其活性增加被認(rèn)為是心肌細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一，與心肌壞死程度呈正相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用異丙腎上腺素作用于大鼠機(jī)體后，血清CK-MB和LDH都明顯升高，表明皮下注射異丙腎上腺素可成功誘導(dǎo)心肌損傷動(dòng)物模型。不同劑量梓醇預(yù)干預(yù)可明顯降低血清CK-MB和LDH的活性（P<0.01），提示梓醇對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌損傷有明顯的保護(hù)作用。

各組大鼠心肌HE染色結(jié)果顯示：在異丙腎上腺素作用下的大鼠中，心肌損傷明顯，心肌細(xì)胞核變形、聚集、排列紊亂，心肌間質(zhì)增寬并部分出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維多處腫脹斷裂，肌橫紋消失，進(jìn)一步證明異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷模型是成功的。應(yīng)用梓醇后，尤其是中劑量和大劑量梓醇可以使壞死面積明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，這一變化趨勢(shì)也在各組大鼠損傷分級(jí)比較中得到體現(xiàn)，上述結(jié)果均提示：梓醇對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷有保護(hù)作用。

炎性細(xì)胞因子是機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志，可進(jìn)一步引起中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移以及最終在心肌組織的積聚，釋放溶酶體酶，損傷心肌細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素作用于大鼠后，大鼠心肌有明顯的炎性細(xì)胞的滲出和間質(zhì)水腫，提示我們炎癥在異丙腎上腺素的心肌損傷中發(fā)揮重要作用TNF-α和IL-1β是誘導(dǎo)炎性細(xì)胞滲出的重要因子，他們可以在多種細(xì)胞因子的刺激下由多種細(xì)胞分泌［13］，有相關(guān)研究表明，在人體心臟損傷時(shí)，上述兩種炎癥因子明顯升高［14］。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［15，16］阻止 TNF-α 和 IL-1β 的表達(dá)可以明顯改善梗死心肌的心功能，因此抑制炎癥反應(yīng)是保護(hù)心肌損傷的一種有效方法。以往的研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可以抑制脂多糖（LPS）引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，限制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性氧自由基（ROS）和一氧化氮（NO），降低誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）的表達(dá)［17］，表明梓醇在LPS介導(dǎo)的炎癥損傷中起到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥因子產(chǎn)生的作用。在Aβ1-42損傷的小鼠大腦皮層神經(jīng)-膠質(zhì)混合細(xì)胞培養(yǎng)體系中，梓醇一方面直接保護(hù)神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性損傷，另一方面通過抑制小膠質(zhì)和星型膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子TNF-α的過量表達(dá)，間接保護(hù)神經(jīng)元，通過抗炎發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［18］。因此為了進(jìn)一步探討梓醇對(duì)心肌損傷的保護(hù)機(jī)制，我們從炎癥角度檢測(cè)了心肌組織TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在異丙腎上腺素處理組的大鼠心肌上述兩種因子表達(dá)明顯升高，而梓醇預(yù)處理后，尤其在中劑量和高劑量梓醇組，上述兩種因子的表達(dá)明顯減少，提示梓醇通過抑制炎癥因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)保護(hù)心肌的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明梓醇可以阻止異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷，這種保護(hù)作用可能是通過抑制炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，此結(jié)果將為篩選具有心肌保護(hù)作用的中藥單體提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論依據(jù)。

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