海洋浮游病毒生態(tài)學(xué)研究方法概述

徐永樂

【摘 要】海洋浮游病毒是海洋生態(tài)系統(tǒng)中豐度最大的生物有機(jī)體，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著中要的作用。海洋浮游病毒的生態(tài)學(xué)研究一直是海洋生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)。其研究方法也在不斷發(fā)展和完善。本文分別對病毒豐度、生產(chǎn)力的測定方法、多樣性的檢測方法以及分離培養(yǎng)鑒定方法及其發(fā)展等方面進(jìn)行了總結(jié)和闡述，并對各部分研究方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了討論分析。

【關(guān)鍵詞】海洋浮游病毒；研究方法；豐度；生產(chǎn)力；多樣性；分離培養(yǎng)

海洋浮游病毒是海洋生態(tài)系統(tǒng)中豐度最大的生物實(shí)體[1]。海洋浮游病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，對宿主的侵染和裂解作用，介導(dǎo)著大約20% 的宿主死亡率，大大加快了物質(zhì)循環(huán)的速度[1]，并且調(diào)節(jié)著宿主群落結(jié)構(gòu)的組成。與此同時，病毒也扮演著介導(dǎo)水平基因轉(zhuǎn)移，促進(jìn)宿主類群進(jìn)化的重要角色[1]。除此之外，海洋病毒宏基因組學(xué)的研究表明海洋浮游病毒類群有著巨大的多樣性，并且包含著大量未知的基因[1， 2]。海洋浮游病毒重要的生態(tài)作用必然使海洋浮游病毒生態(tài)學(xué)的研究成為熱點(diǎn)。

目前，海洋浮游病毒的生態(tài)學(xué)研究主要從豐度，多樣性，病毒介導(dǎo)的宿主死亡率，病毒與宿主的相互作用等方面開展。而目前在各方面生態(tài)學(xué)研究中使用的方法可總結(jié)如下。

1. 海洋浮游病毒豐度的檢測方法

目前用于水生生態(tài)環(huán)境中浮游病毒豐度的測定方法主要有以下3種： 透射電子顯微鏡技術(shù)（TEM），表面熒光顯微鏡技術(shù)（EFM） 和流式細(xì)胞分析檢測技術(shù)（FCM）[3， 4]。

1.1 透射電子顯微鏡技術(shù) （TEM）

透射電子顯微鏡技術(shù)是早期海洋病毒學(xué)研究中病毒定量最常用的方法。使用這項技術(shù)時，要求濃縮海水中的病毒，把濃縮液滴置于銅網(wǎng)上，負(fù)染后鏡檢觀察。這項技術(shù)在檢測病毒豐度的同時還能獲取病毒形態(tài)方面的信息[5]。但該項技術(shù)的檢測的下限高，涉及到海水濃縮，染色，觀察等諸多可能產(chǎn)生誤差的環(huán)節(jié)，并且步驟繁瑣，對操作人員的技術(shù)，儀器的要求都較高[6]。

1.2 表面熒光顯微鏡技術(shù) （EFM）

表面熒光顯微鏡技術(shù)是目前檢測病毒豐度使用最為普遍的方法。其測定操作的步驟為： 將水樣濃縮過濾于孔徑為0.02 μm的濾膜上，然后用熒光染料染色固定，再放在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。EFM比TEM檢測更加精確，快速和節(jié)約成本。但是這種方法的缺點(diǎn)是： 無法識別病毒的形態(tài)特征以及感染能力；無法區(qū)分大的病毒顆粒和細(xì)菌[1]；在計數(shù)時是否會把一些被染色的非病毒顆粒計算上也存在著疑問。

1.3 流式細(xì)胞計數(shù)法 （FCM）

FCM是一種高度靈敏的檢測病毒豐度的手段，能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速精確的分析。FCM對于環(huán)境樣品的檢測不存在一個檢測限的問題，而且能夠基于病毒顆粒體積大小和熒光強(qiáng)度區(qū)分自然水樣中不同的病毒類群。FCM分析也存在和EFM相似的缺點(diǎn)[1]。

2.病毒生產(chǎn)力的估算方法

由病毒介導(dǎo)的宿主死亡率可以通過病毒生產(chǎn)力的測定來估算。目前為止使用過的病毒生產(chǎn)力的測定方法有以下幾種[7]。

2.1 間接的方法—計算病毒死亡率

由于海水中的病毒的數(shù)量是穩(wěn)定不變的，那么病毒的生產(chǎn)力應(yīng)該和死亡率是相同的，所以可以通過檢測病毒的死亡率來估算病毒的生產(chǎn)力。計算病毒的死亡率有幾種不同的方法。首先，在自然海水樣品中加入抑制宿主活動的藥劑來抑制新的病毒的產(chǎn)生，進(jìn)而計算自然海水中病毒群落的變化，進(jìn)一步計算死亡率[8]。其次，向海水中加入某種特定的病毒，培養(yǎng)一段時間后檢測該種病毒的效價的變化，進(jìn)而估算整體病毒的數(shù)量變化[9]。再次，向海水中加入熒光標(biāo)記的病毒，黑暗培養(yǎng)，檢測熒光病毒的數(shù)量及病毒總體數(shù)量的變化，從而計算病毒群落的死亡率[10]。

2.2 TEM 檢測宿主死亡率

用TEM 檢測受感染細(xì)胞是估算由病毒引起的宿主死亡率和病毒生產(chǎn)力最早的方法之一[11]。具體為在TEM上觀察細(xì)胞中有明顯可見的病毒顆粒的細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，從而計算宿主的死亡率，并根據(jù)估計的每個細(xì)胞病毒裂解量大小來估算病毒生產(chǎn)能力。

2.3 放射性同位素標(biāo)記

該種方法是在海水樣品中把病毒分離出來后，加入3H， 32P 或 14C等放射性同位素標(biāo)記的胸腺嘧啶或亮氨酸進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過閃爍計數(shù)計算結(jié)合到病毒核酸或蛋白上放射性同位素的數(shù)量，進(jìn)而估算病毒生產(chǎn)力[12]。這種方法會因細(xì)菌的存在而產(chǎn)生較大的誤差和不穩(wěn)定性。

2.4 稀釋法

稀釋法是目前最為推崇的病毒生產(chǎn)力的估算方法[7]。具體方法是使用切向過濾系統(tǒng)分離細(xì)菌和病毒，最終稀釋海水中的病毒，避免或減少這一時刻的細(xì)胞在釋放病毒之前受到新的侵染，分時取樣，檢測病毒在這一過程中的變化，從而計算病毒的生產(chǎn)力及病毒介導(dǎo)的宿主的死亡率[7， 13]。

3. 海洋浮游病毒多樣性的研究方法

病毒被認(rèn)為是地球上生物多樣性最高的生物實(shí)體之一。目前人們對病毒多樣性的了解還十分有限。不像細(xì)菌中存在如16S rRNA基因通用的分子標(biāo)記那樣，病毒中沒有十分保守通用的基因，所以其多樣性研究的難度較大[1]。目前應(yīng)用于病毒多樣性研究的的分析方法有以下幾種：

3.1 基于PCR的保守基因的分析

盡管整個病毒群落沒有通用的保守分子標(biāo)記，但對病毒進(jìn)行全基因組比對分析時，在一些感染相關(guān)宿主的病毒類群中發(fā)現(xiàn)有一些基因具有保守性。例如真核藻類病毒的DNA聚合酶基因，藍(lán)細(xì)菌病毒的衣殼組裝蛋白基因g20，依賴于RNA的RNA聚合酶基因等基因[14-16]。通過針對這些基因設(shè)計簡并引物，并用其擴(kuò)增環(huán)境樣品，從而研究海洋生態(tài)環(huán)境中某些類群病毒的多樣性特征。

3.2 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

由于海洋浮游病毒基因組大小分布范圍廣，從幾kb到幾百kb不等，因此病毒基因組大小的分布情況在一定程度上可以反映群落結(jié)構(gòu)的多樣性。脈沖電場凝膠電泳 （PFGE） 是一項基因組指紋圖譜分析技術(shù)，把不同大小的基因組以不同的條帶分離開來，根據(jù)可識別的條帶，揭示從海洋樣品中提取出來的病毒在基因組大小組成上的多樣性。并且條帶的深淺可以在一定程度上反映不同類群病毒的豐度[17]。但需要注意的是不同的病毒可能會有相同或相近的基因組大小，所以PFGE只能提供病毒多樣性分析的最小估計。把條帶從膠上切割回收，用特異探針進(jìn)行雜交分析或PCR分析，可以增加PFGE分析的分辨率[18]。

3.3 病毒宏基因組分析

雖然自然環(huán)境中的病毒群落很大，但因其基因組小，相對于細(xì)菌和古菌，建立病毒群落的宏基因組分析要容易很多。病毒宏基因組的方法是用鳥槍法建立環(huán)境病毒基因組文庫，然后通過測序來分析多樣性。病毒宏基因組學(xué)分析使環(huán)境中病毒的總類群的組成和結(jié)構(gòu)的分析成為可能，在最大程度上反映病毒群落的多樣性特征。當(dāng)然這個方法也面臨著一定的挑戰(zhàn)，如環(huán)境中存在著大量的游離的DNA，會在一定程度上造成污染；病毒中存在能殺死克隆宿主的基因，不能克隆的基因以及修飾過的DNA，并且RNA和單鏈DNA 病毒的檢測在此方法中也受到一定的限制[19]。

4.海洋浮游病毒純株的分離及其基本特征的測定

海洋浮游病毒純株的分離是在個體細(xì)胞及種群水平上研究病毒生態(tài)作用的基礎(chǔ)， 可以為研究病毒-宿主相互作用，病毒的基因組學(xué)分析提供更為詳細(xì)的信息，從而更深入地探究病毒在生物地球化學(xué)過程及進(jìn)化歷程中的作用[20]。

4.1 病毒的分離

病毒分離可以分為如下幾個步驟：首先是富集，主要通過分離樣品與宿主的共培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。對于病毒濃度比較低的樣品，可在培養(yǎng)前進(jìn)行濃縮，已提高侵染成功與富集的可能性。其次是侵染實(shí)驗(yàn)，這部分可以根據(jù)宿主是否能在固體培養(yǎng)基上生長而分為雙層平板法和液體法。雙層平板法通過是否有噬菌斑的出現(xiàn)來判定，而液體法通過重復(fù)侵染后宿主細(xì)胞培養(yǎng)液是否被裂解來判定，如果現(xiàn)象不明顯則可通過計數(shù)，看病毒量是否增加。再次是純化，可以在固體培養(yǎng)基上生長的宿主可以通過雙層平板法每次挖單斑實(shí)現(xiàn)，而不能在固體培養(yǎng)基上生長的宿主則通過梯度稀釋法來實(shí)現(xiàn)純化[20]。經(jīng)過3-5次的純化，即可認(rèn)為得到的病毒為純株。

4.2 病毒基本特征的鑒定

純化后的病毒可以通過一步生長曲線來測定在特定宿主中的潛伏期與單細(xì)胞裂解量的大?。煌ㄟ^氯仿敏感實(shí)驗(yàn)來判斷病毒粒子中是否含有脂類物質(zhì)；通過透射電鏡判定病毒的形態(tài)；通過全基因組測序和蛋白質(zhì)組分析來了解其基因和蛋白組成等。從而從個體水平上細(xì)致深入的了解病毒，并為其他生態(tài)學(xué)研究提供詳細(xì)的信息與基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Suttle， C.A. Viruses in the sea [J]. Nature， 2005， 437（15）： 356-361.

[2] Rohwer， F.， Thurber， R.V. Viruses manipulate the marine enviro nment [J]. Nature， 2009， 459： 207-212.

[3] Suttle， C.A. Marine viruses-major players in the global ecosystem [J]. Nature Review， 5： 801-812.

[4] 焦念志等. 海洋微型生物生態(tài)學(xué)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2006.

[5] Borsheim， K.Y.， Bratbak， G. & Heldal， M. Enumeration and biomass estimation of planktonic bacteria and viruses by transmission electron microscopy [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1990， 56（2）： 352-356.

[6] Weinbauer， M.G.， Suttle C.A. Comparison of epifluorescence and transmission electron microscopy for counting viruses in natural marine waters [J]. Aquat. Microb. Ecol.， 1997， 13： 225-232.

[7] Weinbauer M.G.， Rowe J.M.， and Wilhelm S.W.. Determining rates of virus production in aquatic systems by the virus reduction approach [J]. MAVE Chapter 1 2010： 1-8.

[8] Heldal， M.， and Bratbak， G. Production and decay of viruses in aquatic enviro nments [J]. Mar. Ecol. Progr. Ser.， 1991， 72： 205-212.

[9] Garza， D.R.， and Suttle， C.A. The effect of cyanophages on the mortality of Synechococcus spp. and selection for UV resistant viral communities [J]. Microb. Ecol.， 1998， 36（3）： 281-292.

[10] Noble， R.T.， and Fuhrman J.A. Rapid virus productionand removal as measured with fluorescently labeled viruses as tracers [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2000， 66（9）： 3790-3797.

[11] Proctor， L.M.， Okubo， A. and Fuhrman， J.A. Calibrating estimates of phage-induced mortality in marine bacteria： Ultrastructural studies of marine bacteriophage development from one-step growth experiments [J]. Microb. Ecol.， 1993， 25（2）： 161-182.

[12] Steward， G. F.， Wikner， J.， Cochlan， W. P.， Smith， D. C.， and Azam， F. Estimation of virus production in the sea： 2. Field results [J]. Mar. Microb. Food Webs.， 1992a， 6（2）： 79-90.

[13] Wilhelm， S.W.， Brigden， S.M.， and Suttle， C.A. A dilution technique for the direct measurement of viral production： a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters [J]. Microb. Ecol.， 2002， 43（1）： 168-173.

[14] Chen F.， Suttle C.A.， Short S.M. Genetic diversity in marine algal virus communities as revealed by sequence analysis of DNA polymerase genes [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1996， 62： 2869-2874.

[15] Fuller N.J.， Wilson， W.H.， Joint， I.， Mann， N.H. Occurrence of a sequence in marine cyanophages similar to that of T4 g20 and its application to PCR-based detection and quantification techniques [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1998， 64： 2051-2060.

[16] Culley， A.I.， Steward， G.F. New genera of RNA viruses in subtropical seawater， inferred from polymerase gene sequences [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2007， 73： 5937-5944.

[17] Weinbauer M.G. Ecology of prokaryotic viruses [J]. FEMS Microbiol. Rev.， 2004， 28， 127-181.

[18] Wommack， K.E.， Ravel， J.， Hill， R.T. and Colwell， R.R. Hybridization analysis of Chesapeake Bay virioplankton. Appl. Environ. Microbiol.， 1999， 65： 241-250.

[19] Edwards R.A. and Rohwer F. Viral metagenomics [J]. Nature Reviews， 2005， 3： 504-510.

[20] Middelboe， M.， Chan A.M.， and Bertelsen S.K. Isolation and life cycle characterization of lytic viruses infecting heterotrophic bacteria and cyanobacteria [J]. MAVE Chapter 13， 2010： 118-133.