榆樹臍腹小蠹坑道真菌研究

徐 陽(yáng) ，朱曉梅，劉雪峰，2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)

榆樹(Ulmus spp.)是新疆重要的綠化樹種，發(fā)揮著巨大的生態(tài)作用。尤其是白榆(Ulmus pumila)材質(zhì)優(yōu)良，抗病性強(qiáng)，特別是對(duì)全世界毀滅性植物病害——荷蘭榆病(Dutch Elm Disease)具有高度抗病性。但近年來，在我國(guó)新疆地區(qū)，白榆人工林大面積受小蠹蟲危害，并出現(xiàn)零星或成片死亡，危害造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)損失。危害白榆樹的小蠹蟲主要是臍腹小蠹(Scolytus schevyrewi)，它分布在新疆的伊寧、霍城、查布查爾、克拉瑪依、奎屯和阿勒泰地區(qū)等地［1］。臍腹小蠹還分布在中國(guó)北方各省，是韓國(guó)、蒙古、俄羅斯、哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦、吉爾吉斯斯坦、土庫(kù)曼斯坦和塔吉克斯坦的本土害蟲。2003年4月首次在北美地區(qū)干旱的白榆上采集到了該害蟲。到2005年春季，在美國(guó)的亞利桑那州、加利福尼亞州等22個(gè)州都發(fā)現(xiàn)了臍腹小蠹。在美國(guó)從4種榆樹上采集到臍腹小蠹，分別為:U.americana，U.procera，U.pumila和U.thomasii［2］。臍腹小蠹不斷地重復(fù)侵害樹勢(shì)衰弱的植株，加快衰弱的速度，導(dǎo)致被害株迅速死亡。死亡不久砍伐的原木，最適于臍腹小蠹定居繁殖，是主要的蟲源地。在新疆臍腹小蠹蟲危害致死率3～5%，嚴(yán)重地段達(dá)到50%以上。該害蟲1 a發(fā)生2～3代，以老熟幼蟲在樹皮內(nèi)越冬。保證林木健康生長(zhǎng)和消除蟲源地是臍腹小蠹綜合防治的基本環(huán)節(jié)［3］。目前，對(duì)該害蟲的生物學(xué)習(xí)性、發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)等都進(jìn)行了較全面的研究。

Brasier C M(1987)在我國(guó)東北部遼寧省的大連、丹東、沈陽(yáng)、中部陜西省的西安、新疆省的烏魯木齊、吐魯番、瑪納斯和伊寧采集了受到小蠹蟲危害的榆樹詳細(xì)的樣本。從小蠹蟲危害的樣本上分離到了擔(dān)子菌和茄腐鐮刀菌［4］。劉慧珍在新疆烏魯木齊、瑪納斯、石河子、伊犁地區(qū)、河南武險(xiǎn)縣、內(nèi)蒙鑲黃旗和山西文水縣等地，設(shè)置50多塊標(biāo)準(zhǔn)地，對(duì)榆樹次生林、人工林、防護(hù)林、行道樹和“四旁”樹進(jìn)行多次死亡情況調(diào)查，并以病榆木質(zhì)部變色部位和危害榆樹的小蠹蟲為材料，進(jìn)行了真菌分離培養(yǎng)，從小蠹蟲、坑道和病榆樹組織中分離到Graphium putredinis、G.penicillioides及鐮刀菌(Fusarium spp.)、青霉(Penicillium sp.)和茅菌屬(Doratomyces)等多種真菌［5］。

小蠹蟲和真菌的共生是一種廣義上的共生，包括互惠共生、拮抗共生和其他形式的共生［6］。Graham研究認(rèn)為小蠹蟲與真菌共生是小蠹蟲與真菌充分利用森林生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)寄主樹木高纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適應(yīng)性的進(jìn)化結(jié)果［7］。在植物—小蠹蟲—共生真菌系統(tǒng)中，共生真菌在削弱寄主樹木抗性、協(xié)助小蠹蟲侵害樹木中起重要作用，對(duì)某些小蠹蟲或寄主樹木而言，共生真菌甚至是小蠹蟲成功侵害的必要條件［8－9］。目前為止，對(duì)臍腹小蠹蟲坑道真菌研究還不夠深入。為此，本文報(bào)道了臍腹小蠹蟲坑道真菌的分離培養(yǎng)結(jié)果，確定了小蠹蟲坑道真菌群落組成和優(yōu)勢(shì)種群，為研究新疆榆臍腹小蠹蟲與伴生菌關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集

在每一個(gè)調(diào)查樣地選取合適的受害榆樹，將有明顯危害痕跡的木段鋸下帶回實(shí)驗(yàn)室備用。2009年7月從庫(kù)爾勒市、和靜縣、和碩縣和2010年4月從克拉瑪依市總計(jì)采集6段受臍腹小蠹危害的榆木段，見表1。

表1 臍腹小蠹蟲危害木標(biāo)本采集Tab.1 The bark beetle harmed of wood specimen collection

1.2 培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20 g，瓊脂17 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

(2)CSMA培養(yǎng)基:麥芽汁20 g，放線菌酮0.05 g，鏈霉素0.04 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

(3)MEA培養(yǎng)基:麥芽浸提物20 g，蛋白胨1.0 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

(4)CMA培養(yǎng)基:玉米粉20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

(5)WA培養(yǎng)基:瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 坑道真菌分離培養(yǎng)和鑒定

取臍腹小蠹的幼蟲坑道、成蟲羽化后坑道標(biāo)本為分離材料，將其切成大約0.5×0.5 cm小塊，用漂白粉(1∶14)進(jìn)行表面消毒后接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基采用PDA、MEA、MA CMA和CSMA 5種培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放5塊分離材料，設(shè)3個(gè)重復(fù)，分離伴生菌，25℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。另外做一組，分離材料表面不消毒，直接接種在培養(yǎng)基上。

當(dāng)接種材料周圍長(zhǎng)出菌落時(shí)，從中挑取菌絲分離純化菌種。定期觀察菌落生長(zhǎng)情況，同時(shí)進(jìn)行菌種統(tǒng)計(jì)，并統(tǒng)計(jì)分離頻率(檢出率)。

分離頻率=分離到該菌材料數(shù)/該處理材料總數(shù)×100%

將分離純化已產(chǎn)孢的真菌菌落采用直接挑取標(biāo)本，制作成水載片;產(chǎn)生子實(shí)體的真菌采用徒手切片方法，制成水載片，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)特征并測(cè)量、描述，依據(jù)形態(tài)特征參考一些相關(guān)分類學(xué)資料進(jìn)行分類鑒定［10－13］，確定所分離到的真菌的屬(種)。

1.4菌種保存

接種3～4 d以后，待菌落長(zhǎng)出，在解剖鏡下用針尖挑取不同的菌落，接種到PDA培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)，相對(duì)濕度為50%，光照為0級(jí)。待菌種長(zhǎng)出，保存到試管斜面中。

2 結(jié)果分析

2.1 幼蟲坑道木質(zhì)部真菌分離結(jié)果

從庫(kù)爾勒、和靜及和碩3個(gè)地區(qū)采集了4棵樣樹，接種了600塊臍腹小蠹幼蟲木質(zhì)部坑道的小樣，共120皿，分離結(jié)果見表2和表3。從幼蟲坑道木質(zhì)部共分離到真菌12屬，其中庫(kù)爾勒、和靜及和碩3個(gè)樣地分離到的真菌共有屬7個(gè):Fusarium、Graphium、Paecilomyces、Phoma、Alternaria、Penicillium和待定種1。其中，Chaetomium和Cladosporium只從和靜標(biāo)本中分離到的，Candida和Dictyoarthrinium只從和碩標(biāo)本中分離到的。庫(kù)爾勒分離到的真菌種類相對(duì)較少，標(biāo)本B和標(biāo)本C間真菌種類差異較大，共有種類3屬。

幼蟲木質(zhì)部坑道真菌優(yōu)勢(shì)種為Fusarium，滅菌和不滅菌條件下，平均分離率分別為98.33%和100%，其次是待定種1，滅菌和不滅菌條件下，平均分離率分別為15%和39.15%，Graphium滅菌和不滅菌條件下，平均分離率分別為17.09%和22.47%。

從滅菌與不滅菌分離材料上分離真菌的結(jié)果略有差異，滅菌的分離到10屬，不滅菌的分離到11屬，共有屬9個(gè)。其中，Chaetoumium在滅菌的條件下分離出來，Dendrodochium和Dictyoarthrinium在不滅菌條件下分離到的，但是分離率都很低。

應(yīng)用5種培養(yǎng)基分離幼蟲木質(zhì)部坑道真菌分離結(jié)果:PDA培養(yǎng)基上分離到的種類最少，有6屬;其次是CSMA和WA，分別有8屬;MEA和MA培養(yǎng)基上分離到的種類略多，分別為9屬和10屬。其中Fusarium、Graphium、Paecilomyces、Phoma和待定種1是5種培養(yǎng)基上所共有的。

表2 表面滅菌的幼蟲木質(zhì)部坑道真菌Tab.2 The larvae gallery fungi surface sterilized in xylem

表3 表面不滅菌木質(zhì)部坑道真菌Tab.3 The larvae gallery fungi of without surface sterilized in xylem

2.2 幼蟲坑道樹皮真菌分離結(jié)果

在庫(kù)爾勒、和靜及和碩3個(gè)地區(qū)采集了4棵樣樹，接種了600塊臍腹小蠹蟲樹皮坑道的小樣，共120皿，分離結(jié)果見表4和表5。從和碩、和靜標(biāo)本中分離到的真菌較庫(kù)爾勒的多。3個(gè)地區(qū)的共有種類有 6屬:Fusarium、Alternaria、Graphium、Phoma、Penicillium和待定種1。只從和靜標(biāo)本中分離到了Cladosporium和Stilbum，Candida和Dictyoarthrinium只從和碩標(biāo)本中分離到。

幼蟲木質(zhì)坑道與樹皮坑道真菌組成基本相似，只從木質(zhì)坑道分離到Chaetoumium，只從樹皮坑道中分離到Stilbum。說明在小蠹蟲危害的情況下，在小蠹蟲坑道各個(gè)部位的真菌組成上沒有顯著差異，優(yōu)勢(shì)種上也基本相同。

表4 表面滅菌的樹皮坑道真菌Tab.4 The larvae gallery fungi surface sterilized in tree bark

表5 不滅菌樹皮坑道真菌Tab.5 The larvae gallery fungi without surface sterilization in tree bark

2.3 成蟲羽化后的坑道真菌分離結(jié)果

在克拉瑪依地區(qū)采集了2棵樣樹，接種了240塊成蟲羽化后坑道的小樣，共48皿，分離結(jié)果見表6。從中分離到真菌10屬，待定種1個(gè)。滅菌和不滅菌條件下均為10屬，但略有差異，Chalara只在不滅菌的條件下分離到。Fusarium被普遍分離到，為優(yōu)勢(shì)真菌，滅菌和不滅菌條件下，平均分離率分別為為72.5%和67.5%，其它較占優(yōu)勢(shì)的是Monilia、Peyronellaea和Penicillium。

表6 成蟲羽化后坑道真菌Tab.6 The adults gallery fungi after adult emergence

3 結(jié)論與討論

利用5種培養(yǎng)基對(duì)臍腹小蠹幼蟲坑道和成蟲羽化后坑道標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，共分離到真菌18屬，待鑒定的種類有2種。幼蟲坑道中分離到12屬真菌，從木質(zhì)部坑道和樹皮坑道中種類組成較接近。從成蟲羽化后遺留坑道中分離到真菌10屬。

臍腹小蠹幼蟲坑道、成蟲羽化后坑道優(yōu)勢(shì)真菌都為鐮刀菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定為茄腐鐮刀菌(Fsarium solani)，在滅菌和不滅菌條件下，從寄主木質(zhì)坑道和樹皮坑道上以及各種培養(yǎng)基上都能分離到，而且均占優(yōu)勢(shì)。茄腐鐮刀菌在幼蟲坑道、成蟲羽化后坑道中的平均分離率分別是:98.84%、67.50%。與Brasier C M(1987)和劉慧珍(1988)從小蠹蟲危害的榆樹標(biāo)本的分離結(jié)果類似。鐮刀菌屬的真菌代謝產(chǎn)生的對(duì)人畜及植物致病的毒素，同時(shí)也會(huì)對(duì)其他真菌產(chǎn)生抑制作用，這也是從臍腹小蠹坑道中所分離到的真菌種類貧乏的原因。鐮刀菌屬的真菌是重要的植物病原真菌，可以引起多種植物產(chǎn)生枯萎病。從小蠹蟲坑道中分離到的茄腐鐮刀菌參與了臍腹小蠹蟲對(duì)榆樹的危害過程。

成蟲羽化后的坑道真菌與幼蟲坑道真菌共有的屬為:Chaetomium、Fusarium、Graphium和Penicillium;幼蟲坑道的真菌主要有:Alternaria、Candi-da、Cladosporium、Dendrodochium、Dictyoarthrinium、Paecilomyces、Phoma、Stilbum和1個(gè)待定種(NMBA6241);在成蟲道內(nèi)特有的真菌為:Chalara、Gonatobotrys、Monilia、Peyronellaea、Trichoderma、Ulocladium和1個(gè)待定種(YWSB2311)。說明從幼蟲坑道和成蟲坑道所分離到的真菌種類組成有所不同，但是它們的優(yōu)勢(shì)種均為茄腐鐮刀菌?？赡苁怯紫x坑道內(nèi)樹皮和木質(zhì)部被小蠹蟲取食和真菌的分解作用及寄主組織壞死后，坑道內(nèi)的化學(xué)成分和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而引起了真菌群落的改變。

另外，在分離臍腹小蠹坑道真菌時(shí)，建議使用多種培養(yǎng)基，這樣可以增加分離真菌到多更種真菌的機(jī)會(huì)。對(duì)分離材料滅菌和不滅菌對(duì)分離結(jié)果略有影響，在不滅菌條件下分離到的真菌種類普遍較滅菌條件下分離到的種類要豐富。

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