脫氫卡維丁的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)特性研究

史月姣， 謝 輝*， 毛春芹， 張興德， 鄭雪平

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046;2.南京市中醫(yī)院，江蘇南京 210001)

巖黃連為罌粟科植物石生黃堇Corydalis saxicolaBunting的全草及肥大的根莖部，是黔、桂高寒山區(qū)珍貴的中藥材［1］。從巖黃連中分離得到生物堿類化合物具有降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性、降低肝組織羥脯氨酸水平，抑制肝纖維化，減輕肝組織的病變程度等作用。脫氫卡維丁是巖黃連總生物堿中主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解痙、抗菌和增加肝糖元生成的作用［2］。本研究采用大鼠外翻腸囊模型，考察巖黃連總生物堿中主要活性成分脫氫卡維丁在大鼠腸道的吸收特性，并采用人源結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞單層體外培養(yǎng)模型研究脫氫卡維丁的腸轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，為巖黃連生物堿口服制劑研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

脫氫卡維丁對(duì)照品 (批號(hào)111667-200401)、鹽酸維拉帕米對(duì)照品 (批號(hào)100223-200102)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用;巖黃連總生物堿 (本實(shí)驗(yàn)室自制，含脫氫卡維丁10.16%);DMEM培養(yǎng)基 (南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);胎牛血清 (Equitech-BioInc.公司);非必需氨基酸、HEPES粉末、谷氨酰胺、胰蛋白酶、Hank's平衡鹽粉末 (sigma公司);乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

1.2 儀器

ALC-M離體組織器官試驗(yàn)系統(tǒng) (上海奧爾科特生物科技有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(Hearous，德國(guó));320型pH計(jì) (Metller-Toledo分析儀器有限公司);Millicell-ERS跨膜電阻儀 (Millipore，美國(guó));Transwell培 養(yǎng) 板 (NUNC，丹麥);Waters 515型高效液相色譜儀，2487紫外檢測(cè)器 (Waters，美國(guó));Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6120單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(Agilent，美國(guó));渦旋混合儀 (上海滬西分析儀器廠);高速臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 細(xì)胞

Caco-2 TC7細(xì)胞株，由法國(guó) Moniqué Rousset博士饋贈(zèng)。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量 (250±30)g，購(gòu)自蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司，合格證號(hào)SCXK(蘇)2009-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠外翻腸囊模型試驗(yàn)

2.1.1 巖黃連總生物堿溶液的配制 稱取巖黃連總生物堿適量，用新鮮配制的臺(tái)氏液溶解并定容，配制成巖黃連總生物堿質(zhì)量濃度分別為0.03、0.06、0.10 mg/mL的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的含藥臺(tái)氏液，其中脫氫卡維丁的質(zhì)量濃度分別為3.05、6.10、10.16 μg/mL。

2.1.2 外翻腸囊試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［3］，大鼠禁食 (不禁水)12 h，乙醚麻醉后沿腹中線開(kāi)腹，小心地將大鼠腸管與腸系膜剝離，分別取十二指腸(幽門(mén)下1 cm為起始點(diǎn))、空腸上段 (以幽門(mén)下15 cm為起始點(diǎn))、回腸 (以盲腸上20 cm為起始點(diǎn))各7 cm，放入37℃臺(tái)氏液中，沖洗至無(wú)內(nèi)容物流出，小心剝離腸段表面的脂肪和血管。將腸段小心翻轉(zhuǎn)，使腸黏膜層在外，漿膜層在內(nèi)，用手術(shù)線結(jié)扎一端，向囊內(nèi)注入臺(tái)氏液400 μL后結(jié)扎另一端使之呈囊狀物，將其放入已有含藥臺(tái)氏液9 mL的麥?zhǔn)显〔壑?。試?yàn)過(guò)程中保持37℃恒溫，并向浴槽中通入95%O2和5%CO2的混合氣體。分別在15、30、45、60 min取出腸段，用濾紙吸干黏膜面水分，吸取囊內(nèi)液，測(cè)定其中脫氫卡維丁的含量，測(cè)量腸管的長(zhǎng)與寬。

2.1.3 HPLC樣品分析 Agilent XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀-水溶液 (18.5∶81.5);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)347 nm;柱溫30℃。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 臺(tái)氏液中脫氫卡維丁測(cè)定HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogramsofdehydrocavidine in Tyrode

方法學(xué)驗(yàn)證:精密稱取脫氫卡維丁對(duì)照品10.30 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成1.03 mg/mL的脫氫卡維丁貯備液。精密量取貯備液適量分別配制成不同質(zhì)量濃度的脫氫卡維丁對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果表明脫氫卡維丁在1.03～20.60 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積(Y)與質(zhì)量濃度(X)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=35 578.096 1X-3 538.938 7，r=0.999 3。日內(nèi)、日間精密度RSD均低于5%(n=6)，24 h穩(wěn)定性RSD為2.23%，回收率為97.57%±0.45%。

精密吸取腸囊內(nèi)液200 μL，于離心機(jī)中離心10 min(12 000 r/min)，取上清液進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算脫氫卡維丁的質(zhì)量濃度。

2.1.4 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算脫氫卡維丁在各腸段的單位面積滲透量和表觀滲透系數(shù)。表觀滲透系數(shù) (Papp)的計(jì)算公式如下［4］:

式中，dQ/dt為單位時(shí)間藥物滲透量 (ng/s)，A為腸囊表面積 (cm2)，C0為脫氫卡維丁的初始質(zhì)量濃度 (ng/mL)。

脫氫卡維丁在大鼠各腸段的經(jīng)時(shí)滲透曲線見(jiàn)圖2、圖3、圖4，各腸段表觀滲透系數(shù)見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，各腸段脫氫卡維丁的單位面積滲透量均有增加;相同的質(zhì)量濃度下，各腸段脫氫卡維丁的單位面積滲透量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加;十二指腸和空腸的單位面積滲透量比較接近，回腸的單位面積滲透量明顯較小。試驗(yàn)質(zhì)量濃度下同一部位腸段脫氫卡維丁表觀滲透系數(shù)無(wú)顯著性差異，十二指腸與空腸的表觀滲透系數(shù)無(wú)顯著性差異，回腸的表觀滲透系數(shù)較小。

圖2 脫氫卡維丁在大鼠十二指腸的滲透曲線Fig.2 Permeability curve of dehydrocavidine in rat's duodenum

圖3 脫氫卡維丁在大鼠空腸的滲透曲線Fig.3 Permeability curve of dehydrocavidine in rat's jejunum

2.2 Caco-2細(xì)胞單層模型試驗(yàn)

2.2.1 藥物溶液的配制 精密稱取脫氫卡維丁10.59 mg，加入DMSO 2 mL，用超純水稀釋定容至10 mL作為貯備液。將貯備液用 HBSS溶液(pH7.4)稀釋至質(zhì)量濃度為6.99 ng/mL(即20.0 μmol/L)的脫氫卡維丁溶液。

圖4 脫氫卡維丁在大鼠回腸的滲透曲線Fig.4 Permeability curve of dehydrocavidine in rat's ileum

表1 脫氫卡維丁在大鼠各腸段的表觀滲透系數(shù)Tab.1 Apparent permeability coefficient of dehydrocavidine in rat's intestine

精密稱取鹽酸維拉帕米對(duì)照品適量，與上述脫氫卡維丁對(duì)照品貯備液用HBSS(pH7.4)溶解并配制成含鹽酸維拉帕米的脫氫卡維丁溶液，其中脫氫卡維丁的質(zhì)量濃度為6.99 ng/mL，鹽酸維拉帕米為9.80 ng/mL。

2.2.2 雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn) 參考文獻(xiàn) ［5-7］，建立Caco-2細(xì)胞單層模型。試驗(yàn)前首先用37℃預(yù)熱的Hank's平衡鹽溶液 (HBSS，pH7.4)溶液洗滌細(xì)胞單層3次，用跨膜電阻儀檢測(cè)跨膜電阻，各孔跨膜電阻值均大于空白對(duì)照值100 hm/4.2 cm2以上，即符合實(shí)驗(yàn)要求可用于試驗(yàn)。加入預(yù)熱的HBSS(pH7.4)溶液，于37℃搖床中孵育1 h，吸棄HBSS(pH7.4)溶液。

脫氫卡維丁從A側(cè)到B側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn):將脫氫卡維丁溶液加至細(xì)胞絨毛面Apical(A)側(cè)為供給液，同時(shí)將空白HBSS(pH7.4)溶液加至細(xì)胞基底面Basolateral(B)側(cè)作為接收液，將Transwell培養(yǎng)板置于轉(zhuǎn)速為50 r/min的37℃恒溫?fù)u床中，分別在0、1、2、3、4 h吸取供給池、接收池溶液各400 μL待測(cè)，同時(shí)補(bǔ)加等容積相應(yīng)的溶液。

脫氫卡維丁從B側(cè)到A側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn):將脫氫卡維丁溶液加至B側(cè)作為供給液，空白的HBSS(pH7.4)溶液加至A側(cè)作為接收液，其余操作與上述從A側(cè)到B側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)相同。

鹽酸維拉帕米對(duì)脫氫卡維丁雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響:對(duì)含鹽酸維拉帕米的脫氫卡維丁溶液按上述操作進(jìn)行雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

2.2.3 HPLC/MS樣品分析 Sapax BR-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)(蘇州賽分科技有限公司);Sapax BR-C18保護(hù)柱 (2.0 mm×10 mm，1.8 μm)(蘇州賽分科技有限公司);流動(dòng)相為0.1%甲酸-甲醇 (70∶30);體積流量0.2 mL/min;柱溫30℃。

質(zhì)譜條件:ESI;工作模式:SIM;m/z350;裂解電壓150 V;毛細(xì)管電壓3 000 V;噴霧器壓力206.82 kPa;脫溶劑溫350℃;脫溶劑氣體體積流量480 L/h。色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 HBSS中脫氫卡維丁測(cè)定HPLC/MS圖Fig.5 HPLC/MS chromatograms of dehydrocavidine in HBSS

方法學(xué)驗(yàn)證:精密量取脫氫卡維丁貯備液適量分別稀釋配制成不同質(zhì)量濃度的脫氫卡維丁對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，脫氫卡維丁在0.10～105.90 ng/mL范圍內(nèi)，峰面積值 (Y)與質(zhì)量濃度 (X)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=420.423 3X+7.387 1，r=0.999 9。日內(nèi)、日間精密度RSD均低于2%(n=6)，24 h穩(wěn)定性RSD為1.10%，回收率為98.33%±0.71%。

在上述轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)取樣溶液中，精密加入甲醇400 μL，渦旋混勻，于離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算脫氫卡維丁的質(zhì)量濃度。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析 計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)轉(zhuǎn)運(yùn)量，并按2.1.4項(xiàng)下公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)，公式中A為轉(zhuǎn)運(yùn)膜的面積4.2 cm2。

脫氫卡維丁雙向累計(jì)轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖6，表觀滲透系數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖6 脫氫卡維丁1-4 h跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量Fig.6 Cumulative transport amount of dehydrocavidine in 1-4 hours

表2 脫氫卡維丁的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)行為及鹽酸維拉帕米對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Tab.2 Bi-directional transport characteristics of dehydrocavidine and the influence of transport by verapamil hydrochloride

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，脫氫卡維丁的累計(jì)轉(zhuǎn)運(yùn)量逐漸增加，兩者間呈較好的正相關(guān)性。脫氫卡維丁從B側(cè)到A側(cè)的滲透系數(shù)即分泌滲透系數(shù) (PBA)比其吸收滲透系數(shù)PAB大 (P＜0.05)，兩者均值的比值即外排比率PBA/PAB＞4，提示脫氫卡維丁在小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中存在載體的外排作用。

Caco-2細(xì)胞單層頂側(cè)膜上有豐富的P-gp的表達(dá)，鹽酸維拉帕米為P-gp抑制劑，鹽酸維拉帕米能顯著促進(jìn)脫氫卡維丁通過(guò)Caco-2單層細(xì)胞模型的A到B側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量。加入鹽酸維拉帕米后，脫氫卡維丁的吸收滲透系數(shù)增加了2.68倍，脫氫卡維丁在Caco-2細(xì)胞模型中的外排比率比未加鹽酸維拉帕米的對(duì)照組下降了75.56%，提示脫氫卡維丁在Caco-2細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)存在P-gp的外排作用。

3 討論

口服給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)中，活性成分在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)是影響生物利用度的重要因素。本研究首先采用外翻腸囊模型考察不同質(zhì)量濃度巖黃連生物堿中脫氫卡維丁在大鼠不同腸段的轉(zhuǎn)運(yùn)特性。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巖黃連總生物堿在臺(tái)氏液中質(zhì)量濃度超過(guò)0.1 mg/mL時(shí)不能完全溶解，為避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，最高質(zhì)量濃度選擇0.1 mg/mL，結(jié)合藥效試驗(yàn)劑量，最低質(zhì)量濃度選擇0.03 mg/mL。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巖黃連總生物堿中脫氫卡維丁在不同部位的離體腸囊內(nèi)均有吸收，但表觀滲透系數(shù)均較小。脫氫卡維丁在回腸的滲透性小于十二指腸與空腸。試驗(yàn)質(zhì)量濃度下，同一部位腸段脫氫卡維丁表觀滲透系數(shù)無(wú)顯著性差異，表現(xiàn)出被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的特征。

腸壁細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)存在的藥物外排泵如P-gp和MRP等，能將藥物從腸漿膜轉(zhuǎn)到腸黏膜而排入腸腔，從而導(dǎo)致藥物吸收量減少。本項(xiàng)目前期研究制得的巖黃連提取物中生物堿類成分占56.89%，通過(guò)紫外光譜、高分辨質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果表明其中含多種原小檗堿類化合物，主要包括脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿等。文獻(xiàn)研究顯示，鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)均受P-gp外排作用影響［8-10］，這兩種成分的量在制備的提取物中僅次于脫氫卡維丁。為了考察P-gp是否影響同為原小檗堿型生物堿的脫氫卡維丁的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)，本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)一步研究脫氫卡維丁雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)行為。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多具有飽和性，本研究在設(shè)定濃度時(shí)，選用了較低的藥物濃度 (20 μmol/L)，避免了可能存在的外排蛋白被飽和現(xiàn)象對(duì)結(jié)果的影響。脫氫卡維丁在試驗(yàn)濃度下轉(zhuǎn)運(yùn)4 h試驗(yàn)結(jié)束后未見(jiàn)細(xì)胞跨膜電阻下降，說(shuō)明在該濃度條件下不會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞毒性。通過(guò)研究P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米添加前后脫氫卡維丁雙向轉(zhuǎn)運(yùn)行為的變化，發(fā)現(xiàn)脫氫卡維丁在Caco-2細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)存在P-gp的外排作用。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，分析認(rèn)為脫氫卡維丁的腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)存在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排機(jī)制，但在提取物中多種生物堿組分共存條件下，因轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排的飽和而呈現(xiàn)一定的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)特征。其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在脫氫卡維丁跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的影響有待進(jìn)一步研究。

［1］中國(guó)科學(xué)院廣西植物所.廣西植物志［M］.南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1993:410.

［2］陳重陽(yáng)，趙 一.中藥巖黃連主要成分脫氫卡維丁的藥理研究［J］.中藥通報(bào)，1982，2:31-34.

［3］魏 偉，吳希美，李元建，主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) (第4版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010，526.

［4］Artursson P，Karlsson J.Correlation between oral drug absorptionin in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial(Caco-2)cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1991，175(3):880-885.

［5］Hu M，Chen J，Tran D，et al.The Caco-2 cell monolayers as an intestinal metabolism model:metabolism of dipeptide PhePro［J］.Drug Target，1994，2:79-89.

［6］Hu M，Chen J，Zhu Y，et al.Mechanism and kinetics of transcellular transport of a new β-actam antibiotic loracarbef across a human intestinal epithelial model system(Caco-2)［J］.Phrm Res，1994，11:1405-1413.

［7］陳 彥，賈曉斌，胡 明，等.淫羊藿苷在Caco-2細(xì)胞單層模型中的吸收機(jī)制［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(10):1164-1167.

［8］張新峰，裘福榮，蔣 健，等.LC-MS/MS測(cè)定藥根堿、巴馬汀和小檗堿在Caco-2細(xì)胞的攝取特性［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(19):1504-1508.

［9］Maeng H J，Yoo H J，Kim I W，et al.P-glycoprotein-mediated transport of berberine across Caco-2 cell monolayers［J］.J Pharm Sci，2002，91:2614-2621.

［10］PanG Y，Wang G J，LiuX D，et al.The involvement of P-glycoprotein in berberine absorption［J］.Pharmacol Toxicol，2002，91:193-197.