貯存溫度對(duì)原料羊乳中微生物的影響

李龍柱，李文峰，馬婷婷，張富新，蘇偉麗，趙見軍，烏 素，艾 對(duì)，常 盈，劉 玲

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

乳是人類膳食中營(yíng)養(yǎng)成分最完全、最易消化吸收的食品，營(yíng)養(yǎng)學(xué)家將之稱為“白色血液”和“最接近完善的食品”[1-3]。然而，乳也極易被微生物污染，是微生物生長(zhǎng)繁殖的天然培養(yǎng)基[4-6]。在原料乳生產(chǎn)中，擠奶環(huán)境和貯存溫度對(duì)乳中微生物有較大的影響，尤其是在原料乳貯存期間，微生物持續(xù)生長(zhǎng)繁殖，易引起乳的衛(wèi)生質(zhì)量下降[1，4-6]。從衛(wèi)生角度來看，原料乳中的微生物大致可分為大腸菌群、嗜冷菌、嗜熱菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌。目前，人類利用的乳類主要以牛乳為主，在原料乳生產(chǎn)中，牛乳大多采用機(jī)器擠奶并立即冷卻后，利用機(jī)械制冷低溫貯存[1，7-8]，有效地抑制了牛乳在貯存過程中微生物的生長(zhǎng)及繁殖。羊乳的化學(xué)組成與牛乳相似，富含多種人體必需氨基酸，脂肪球體積小，且乳糖含量更最接近人乳，易于消化吸收，也是世界上公認(rèn)的最接近人乳的乳源[7-9]。但由于奶山羊養(yǎng)殖規(guī)模與奶牛相比較小而且飼養(yǎng)較為分散，機(jī)器擠奶設(shè)備及冷鏈貯存與運(yùn)輸系統(tǒng)還不十分完善，故原料羊乳中微生物污染更為嚴(yán)重，對(duì)其加工產(chǎn)品質(zhì)量造成較為嚴(yán)重的影響。國(guó)內(nèi)外原料羊乳的貯存大多用機(jī)械制冷貯奶倉[7-9]，有效地提高了原料羊乳貯藏期間的衛(wèi)生質(zhì)量，但是，不同的貯存溫度和貯存時(shí)間會(huì)造成原料羊乳及其乳制品品質(zhì)有較大的差別。目前，在有關(guān)原料羊乳在貯存過程中微生物的研究未見報(bào)道。因此，本文對(duì)原料羊乳在不同貯存溫度下菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、嗜熱菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌的變化進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，為進(jìn)一步提高原料羊乳的衛(wèi)生質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊乳 采自陜西某乳品企業(yè)3個(gè)奶山羊養(yǎng)殖小區(qū)，每個(gè)養(yǎng)殖小區(qū)選取10只奶山羊，取樣后立即放置于溫度為4℃的冰壺中，2h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理；平板瓊脂計(jì)數(shù)培養(yǎng)基[5-9]用于羊乳中菌落總數(shù)和嗜熱菌的測(cè)定；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基 用于羊乳中大腸菌群的測(cè)定；CVT培養(yǎng)基 用于羊乳嗜冷菌的測(cè)定；三丁酸甘油酯瓊脂培養(yǎng)基 用于羊乳中脂肪分解菌的測(cè)定；改良乳平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基[5]用于羊乳中蛋白分解菌的測(cè)定。

JND-50型恒溫冷藏箱 寧波江南儀器廠；QL-866型小型漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限責(zé)任公司；移液槍（100～1000μL和10～100μL）德國(guó)艾本德股份有限公司；XK97-A型菌落計(jì)數(shù)器 姜堰市新康醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-100A-17型立式壓力蒸汽滅菌鍋、GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、HHS21-4-45型數(shù)顯式電熱水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；JY301型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PE-20-43型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限責(zé)任公司；MDF-U5411型低溫冰箱 日本三洋電機(jī)公司；HYC-260-66-1型生物試劑柜 Haier有限責(zé)任公司；BSC-1300-II-A56型生物安全柜 蘇州尚田潔凈技術(shù)有限責(zé)任公司；UPT-1-40-L-32型優(yōu)普UPT系列超純水器 成都超純科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法 羊乳中菌落總數(shù)的測(cè)定：按GB 4789.2-2010[11-13]中菌落總數(shù)的測(cè)定方法，36℃培養(yǎng)48h，之后進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以cfu/mL表示。

大腸菌群的測(cè)定：按GB 4789.3-2010[14-15]中大腸菌群的測(cè)定方法，36℃培養(yǎng)24h，之后進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以cfu/mL表示。

嗜冷菌的測(cè)定：按紀(jì)振杰等[10]方法中嗜冷菌的測(cè)定方法，21℃培養(yǎng)18～25h，之后進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以cfu/mL表示。

嗜熱菌的測(cè)定：按Villar[5]、D’amico[6]、Fook等[8]方法中嗜熱菌的測(cè)定方法，乳樣樣品需要在62.8℃條件下處理30min，30℃培養(yǎng)72h，之后進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以cfu/mL表示。

蛋白分解菌和脂肪分解菌的測(cè)定：分別按Villar[5]、D’amico[6]、Fook等[8]方法中蛋白分解菌和脂肪分解菌的測(cè)定方法，30℃培養(yǎng)72h，之后進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以cfu/mL表示。

1.2.2 貯存方法 在各個(gè)選取的養(yǎng)殖小區(qū)內(nèi)，先用毛巾蘸取40℃左右的熱水擦拭奶山羊乳房，并用另一條毛巾擦干，手工擠奶棄去前三把乳之后，直接將需要的乳樣裝入滅過菌的取樣管中，并迅速放入冰壺中；1h后帶回實(shí)驗(yàn)室，在無菌操作臺(tái)中將冷卻后的乳樣分裝入提前滅過菌并干燥的試管中，分別在3、10、25、37℃下貯存0、6、12、18、24、30、36h，測(cè)定菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、嗜熱菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存溫度對(duì)羊乳中菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)（Total bacterial count）是乳被微生物污染的總體情況，是反映原料乳衛(wèi)生質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)[5-8，16-18]。

圖1 貯存溫度對(duì)羊乳中菌落總數(shù)的影響Fig.1 Influence of storage temperature on the total bacterial count

由圖1可以看出，羊乳在貯存過程中，乳中菌落總數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸增大的趨勢(shì)，但不同貯存溫度下菌落總數(shù)變化速度有較大差異。羊乳分別在37、25℃下貯存4、6h時(shí)，羊乳中菌落總數(shù)已達(dá)到國(guó)標(biāo)GB 19301-2010[4]中所規(guī)定收購生鮮乳的微生物指標(biāo)（2×106cfu/mL），貯存6、18h后，菌落總數(shù)迅速上升，顯著高于10℃和3℃下的菌落總數(shù)（p＜0.05）。而在10℃和3℃貯存羊乳36h，菌落總數(shù)變化速度差異不大（p＞0.05）。由此可見，羊奶37、25℃下貯存時(shí)間分別不能超過4、6h，而在10℃和3℃下可貯存36h。羊乳中菌落總數(shù)在不同貯存溫度下都能保持一定的時(shí)間不變，其原因是生鮮乳中含有多種抗菌性物質(zhì)，對(duì)乳中的微生物具有殺菌或抑制作用，生鮮乳在不同的貯存溫度下都有短暫的抑菌期，在抑菌期內(nèi)，乳中的菌落總數(shù)不會(huì)增加[17-23]。原料羊乳如果貯存得當(dāng)菌落總數(shù)變化速度較慢，但是如果貯存溫度過高或者貯存時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)引起菌落總數(shù)的急劇上升，因此在榨乳后應(yīng)該立即冷卻，進(jìn)行低溫短時(shí)貯存。

2.2 貯存溫度對(duì)羊乳中大腸菌群的影響

大腸菌群（Coliform）能從總體上反映出奶山羊在擠奶過程中乳汁被糞便和腸道菌污染的程度[16-19]。

由圖2可以看出，在羊乳貯存過程中，羊乳中大腸菌群數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，但不同溫度下大腸菌群數(shù)變化速度有較大差異。原料羊乳在37℃下貯存6h后，大腸菌群數(shù)迅速上升，明顯高于其他貯存溫度下的大腸菌群數(shù)（p＜0.05）；在25℃和10℃下貯存12h后，大腸菌群數(shù)迅速上升；而在3℃下貯存36h，大腸菌群數(shù)變化差異不顯著（p＞0.05）。由此可見隨著貯存溫度的升高，大腸菌群生長(zhǎng)繁殖速度加快，這是因?yàn)檠蛉橹械拇竽c菌群的最適宜生長(zhǎng)繁殖溫度是35℃[17-23]。大腸菌群數(shù)量越高，表明原料羊乳被糞便和腸道菌污染的程度的越大，在擠奶過程和貯存過程中應(yīng)該加強(qiáng)衛(wèi)生管理[19-23]。原料羊乳如果貯存得當(dāng)，其大腸菌群數(shù)量變化速度較小，但是如果貯存溫度過高或者貯存時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)引起大腸菌群數(shù)量的激增，因此在榨乳后應(yīng)該盡量避免污染且低溫短時(shí)貯存。

圖2 貯存溫度對(duì)原料羊乳中大腸菌群的影響Fig.2 Influence of storage temperature on the coliform

2.3 貯存溫度對(duì)羊乳中嗜冷菌的影響

嗜冷菌（Psychrophic bacteria）是指能在較低溫度下生長(zhǎng)繁殖的一類微生物的總稱，主要包括耶氏菌、李斯特菌和假單胞菌等[10，24-30]。嗜冷菌能夠反映出原料乳在低溫貯存期間及冷鏈運(yùn)輸過程中被嗜冷微生物污染以及其繁殖生長(zhǎng)的情況。如果原料羊乳在貯存和運(yùn)輸過程中嗜冷菌急劇生長(zhǎng)繁殖，則會(huì)給乳制品加工中的預(yù)巴殺和巴氏殺菌工藝帶來嚴(yán)重產(chǎn)品質(zhì)量缺陷，因?yàn)樵涎蛉橹械氖壤渚鷷?huì)產(chǎn)生大量的耐熱性的酶，如果巴氏殺菌溫度過高雖然可以讓這些酶類失活但也會(huì)造成羊乳熱不穩(wěn)定性，進(jìn)而產(chǎn)生掛壁和絮狀沉淀，而且也可能使羊乳中芽孢激活[24-34]；如果巴氏殺菌溫度過低雖然能保證羊乳不變質(zhì)，但是卻不能使這些酶類失活，這將會(huì)讓羊乳乳制品在貯藏和運(yùn)輸過程產(chǎn)生膻味和不能接受的滋氣味，并導(dǎo)致羊乳乳制品貨架期縮短。

從圖3中可以看出，貯存溫度對(duì)原料羊乳中的嗜冷菌有較大的影響，羊乳中嗜冷菌數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，但不同溫度下嗜冷菌數(shù)變化速度有較大差異。在低溫下貯存，貯存溫度越低和貯存時(shí)間越長(zhǎng)時(shí)，羊乳中嗜冷菌數(shù)量變化速度越快。根據(jù)黃艾祥等[23]的研究，當(dāng)原料乳中嗜冷菌數(shù)量超過1×103cfu/mL時(shí)，會(huì)顯著影響其液態(tài)乳制品的品質(zhì)。羊乳在10℃和3℃下貯存，前12h嗜冷菌數(shù)量保持穩(wěn)定；12h以后，羊乳中嗜冷菌數(shù)迅速上升，顯著高于其他貯存溫度下的嗜冷菌數(shù)（p＜0.05），在12h時(shí)其數(shù)量分別達(dá)到6×105cfu/mL和4.5×105cfu/mL，顯著高于1×103cfu/mL；嗜冷菌在貯存和運(yùn)輸過程中開始時(shí)基本維持不變，溫度越接近最適生長(zhǎng)溫度7℃時(shí)增加越快，原因可能是嗜冷菌先經(jīng)歷一個(gè)延遲期，適應(yīng)環(huán)境后開始繁殖，更適合在低溫的環(huán)境中生長(zhǎng)[24-35]。羊乳在37℃和25℃下貯存時(shí)，其嗜冷菌數(shù)量在前12h時(shí)變化不大（p＞0.05），貯存12h以后，嗜冷菌數(shù)量逐漸增大，尤其是在貯存18h時(shí)，羊乳中嗜冷菌數(shù)量分別達(dá)到1.53×105cfu/mL和2.3×105cfu/mL，已經(jīng)高于1×103cfu/mL這一數(shù)值（p＜0.05）。由此可見，低溫較適合嗜冷菌生長(zhǎng)，而高溫可抑制嗜冷菌的生長(zhǎng)；低溫長(zhǎng)時(shí)間貯存和運(yùn)輸不利于控制原料羊乳中的嗜冷菌數(shù)量的變化。

圖3 貯存溫度對(duì)原料羊乳中嗜冷菌的影響Fig.3 Influence of storage temperature on the psychrophilic bacteria

2.4 貯存溫度對(duì)羊乳中嗜熱菌的影響

嗜熱菌（Thermophilic bacteria）是一類能在較高溫度下殘存的微生物，主要包括各種芽孢和芽孢桿菌[5-8，20-23]等，它反映乳在熱處理過程中嗜熱微生物生長(zhǎng)繁殖情況。

圖4 貯存溫度對(duì)原料羊乳中嗜熱菌的影響Fig.4 Influence of storage temperature on the thermophilic bacteria

從圖4可以看出，原料羊乳中嗜熱菌數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，但不同溫度下嗜熱菌數(shù)變化速度有較大差異。羊乳在37℃和25℃下貯存0～6h期間，嗜熱菌數(shù)迅速上升，明顯高于10℃和3℃下的嗜熱菌數(shù)量（p＜0.05）。而原料羊乳3℃下貯存36h，嗜熱菌數(shù)量變化速度差異不大（p＞0.05）。根據(jù)黃艾祥等[23]的研究，當(dāng)原料羊乳中嗜熱菌超過10～102cfu/mL，會(huì)顯著影響其液態(tài)乳制品的貨架期。在37℃下貯存6h時(shí)，原料羊乳中嗜熱菌數(shù)量已達(dá)到1.22×103cfu/mL，顯著超過10～102cfu/mL這一數(shù)值。隨著貯存期延長(zhǎng)嗜熱菌數(shù)量有所增加，而通常嗜熱菌大多為耐熱芽孢菌，具有極強(qiáng)的耐熱性，即使高溫處理后，仍然可能會(huì)殘存[5，20-23]。由此可見，較高貯存溫度是影響原料羊乳中嗜熱菌生長(zhǎng)和繁殖的一個(gè)重要因素，所以要避免其在高溫下貯存過長(zhǎng)時(shí)間。

2.5 貯存溫度對(duì)羊乳中蛋白分解菌的影響

蛋白分解菌（Proteolytic bacteria）是一類能分解乳蛋白的嗜中溫細(xì)菌[5-8，23]，對(duì)乳及乳制品的滋氣味、口感以及貨架期等有重要影響。蛋白分解菌所分泌的蛋白酶能將原料羊乳中蛋白質(zhì)分解為多肽類和氨基酸[5-8]，這將會(huì)引起乳制品的不良滋氣味，進(jìn)而影響乳制品的貨架期[35-37]。

圖5 不同貯存溫度對(duì)原料羊乳中蛋白分解菌的影響Fig.5 Influence of storage temperature on the proteolytic bacteria

從圖5可以看出，原料羊乳中蛋白分解菌數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，但不同溫度下蛋白分解菌數(shù)變化速度有較大差異。原料羊乳在37℃和25℃下貯存，羊乳中蛋白分解菌數(shù)量迅速上升，明顯高于10℃和3℃下的蛋白分解菌數(shù)量（p＜0.05）。而原料羊乳在3℃、10℃下貯存36h，蛋白分解菌變化速度差異不顯著（p＞0.05）。由此可見，羊乳在10℃和3℃下短時(shí)貯存，可有效抑制其中蛋白分解菌的生長(zhǎng)和繁殖。其原因主要是在低溫下貯存時(shí)，一般適宜于嗜中溫條件下繁殖的微生物[24-30]，在低溫環(huán)境生長(zhǎng)處于抑制狀態(tài)，即屬于低溫類的微生物雖然能夠繁殖，但是其生長(zhǎng)和繁殖速度非常緩慢，因此在低溫下貯存一段時(shí)間，嗜中溫微生物基本穩(wěn)定[31-36]，因此低溫貯存是保證原料羊乳衛(wèi)生質(zhì)量的重要保證。

2.6 貯存溫度對(duì)羊乳中脂肪分解菌的影響

脂肪分解菌（Lipolytic bacteria）是一類能分解乳中脂肪的嗜中溫細(xì)菌[5-8]，對(duì)乳及乳制品的風(fēng)味有重要的影響。

從圖6可以看出，原料羊乳中脂肪分解菌數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但不同溫度下脂肪分解菌數(shù)變化速度有較大的差異。原料羊乳分別在37℃下貯存6h、25℃下12h以后，原料羊乳中的脂肪分解菌數(shù)迅速上升，36h時(shí)分別達(dá)到5.2×106cfu/mL和7.8×106cfu/mL，明顯高于10℃和3℃下貯存時(shí)的脂肪分解菌數(shù)量（p＜0.05）。由此可見，貯存溫度和時(shí)間是影響原料羊乳脂肪分解菌數(shù)量的重要因素；在低溫（10℃和3℃）和短時(shí)間（6h）貯存時(shí)，可有效抑制其中脂肪分解菌的生長(zhǎng)和繁殖。原料羊乳在高溫和長(zhǎng)時(shí)間下貯存時(shí)脂肪分解菌會(huì)對(duì)羊乳中乳脂肪有降解作用[29-30]，導(dǎo)致原料乳脂肪球膜破裂，造成乳脂肪球上浮，同時(shí)使游離脂肪酸濃度升高，增加羊乳和羊乳乳制品的膻味[37-41]。

圖6 不同貯存溫度對(duì)原料羊乳中脂肪分解菌的影響Fig.6 Influence of storage temperature on the lipolytic bacteria

3 結(jié)論

本文對(duì)不同貯存溫度下原料羊乳中微生物變化規(guī)律進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

3.1 原料羊乳在3℃下貯存36h，乳樣中菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜熱菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌變化不顯著，嗜冷菌變化差異顯著。

3.2 在10℃下貯存24h后，乳樣中菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌變化差異顯著，嗜熱菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌變化不顯著。

3.3 當(dāng)貯存溫度為37℃和25℃時(shí)，分別貯存6h和12h以后乳樣中的菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜熱菌、蛋白分解菌和脂肪分解菌變化差異顯著，而嗜冷菌變化差異不顯著。隨著貯存溫度的升高和貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，原料羊乳中微生物數(shù)量增加。

在原料羊乳的貯存和運(yùn)輸過程中，應(yīng)盡可能將貯存溫度控制在3℃，貯存時(shí)間不應(yīng)該超過36h，以提高原料羊乳的衛(wèi)生質(zhì)量，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的羊乳乳制品奠定基礎(chǔ)。

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