五倍子抗蕃茄晚疫病原菌有效成分提取工藝研究

宋琳琳，李正英，陳 萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

五倍子（Galla Chinensis），又名為文蛤，木附子，百蟲倉(cāng)[1]，主要的化學(xué)成分為鞣質(zhì)和沒食子酸[2-3]。五倍子能夠抑制多種微生物[4-5]，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。蕃茄晚疫病俗稱“過(guò)火風(fēng)”[6]，是毀滅性的世界蔬菜病害之一，一旦流行將會(huì)給蕃茄帶來(lái)不可估量的損失。由于現(xiàn)在的農(nóng)藥大多數(shù)是有機(jī)磷農(nóng)藥[7-8]，對(duì)人體的傷害很大[9]，但是不使用這些農(nóng)藥將無(wú)法控制這種病害。而大多數(shù)中藥對(duì)人體沒有傷害或很小，所以選擇有抗菌作用的中藥來(lái)抑制對(duì)蕃茄的病害。其中，五倍子具有很好的抗菌作用，價(jià)格低廉，是首選材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五倍子 購(gòu)于內(nèi)蒙古呼和浩特市京遠(yuǎn)大藥房；蕃茄晚疫病原菌（Tomato Late Blight）購(gòu)于中國(guó)農(nóng)科院；甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇 均購(gòu)于天津市化學(xué)試劑三廠，分析純；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；

RE-52AAA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司；VD-1320型無(wú)菌操作臺(tái) 哈爾濱東聯(lián)電子公司；MJX-150BX型霉菌培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；KG-SX-700型滅菌鍋 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將蕃茄晚疫病原菌接種于滅菌后的PDA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)72h，活化三次，將第三代菌種采用平板計(jì)數(shù)法，用滅菌后的生理鹽水稀釋成1×106CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 五倍子中抑菌物質(zhì)的提取工藝 五倍子去蟲癭→稱取5.00g五倍子粗粉→置于三角瓶中→加入溶劑→水浴保溫回流提取→離心（3000r/min，15min）→收集提取液，取沉淀加入提取溶劑→水浴保溫回流提→離心（3000r/min，15min）→收集提取液→合并提取液→真空濃縮→定容10mL。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)方法 采用牛津杯法[10]。配制PDA培養(yǎng)基，滅菌，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固。將200μL菌懸液接入培養(yǎng)基中，涂布均勻。用滅菌的鑷子將滅菌后的牛津杯放在培養(yǎng)基上，將200μL待測(cè)液注入牛津杯中，以待測(cè)液的溶劑作為對(duì)照，平行3次，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，測(cè)量抑菌圈的大小，并照相。

1.2.4 抑菌物質(zhì)提取工藝

1.2.4.1 提取溶劑的選擇 稱取5.00g五倍子粗粉十一份，置于不同的三角瓶中，按1.2.2的提取工藝，料液比為1∶15分別在40℃回流提取，然后按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳溶劑。

1.2.4.2 提取溫度的選擇 稱取5.00g五倍子粗粉五份，置于不同的三角瓶中，根據(jù)1.2.4.1所確定的最佳提取溶劑，料液比為1∶15，按1.2.2的提取工藝，分別在20、40、60、80、100℃中回流提取。然后按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳溫度。

1.2.4.3 提取時(shí)間的選擇 稱取5.00g五倍子粗粉五份，置于不同的三角瓶中，根據(jù)以上所確定的最佳提取的提取條件，料液比為1∶15，按1.2.2的提取工藝，分別在1、2、3、4、5h的條件下回流提取，然后按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳提取時(shí)間。

1.2.4.4 料液比的選擇 稱取5.00g五倍子粗粉五份，置于不同的三角瓶中，根據(jù)以上所確定的最佳提取的條件，按1.2.2的提取工藝，分別在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的條件下回流提取。按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳料液比。

1.2.4.5 浸提次數(shù)的選擇 稱取5.00g五倍子粗粉四份，置于不同的三角瓶中，根據(jù)所確定的最佳提取的條件，按1.2.2的提取工藝，提取次數(shù)分別在1、2、3、4次進(jìn)行提取。按1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)抑菌圈的大小確定最佳提取次數(shù)。

1.2.5 最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)和最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn) 采用倍數(shù)稀釋法[11]，取具塞試管七支編號(hào)，分別加5mL的PDB液體培養(yǎng)基。取1g/mL的五倍子粗提液5mL加到一號(hào)試管中混勻，從一號(hào)試管中取5mL加到二號(hào)試管中以此類推，加到六號(hào)試管為止，再將第六支試管棄去5mL。即各試管中藥液的濃度分別為250、125、62.5、31.3、15.7、7.9mg/mL，以不加五倍子粗提液為空白對(duì)照，滅菌。將每支試管中加入100μL菌懸液，28℃，150r/min，培養(yǎng)72h。觀察試管是否渾濁，不渾濁記為“-”；渾濁即為“+”，以未渾濁的濃度作為最小抑菌濃度。從每只試管中取200μL加到PDA培養(yǎng)基中，涂布均勻，培養(yǎng)72h。無(wú)菌落生長(zhǎng)則記為“-”；有菌落生長(zhǎng)記為“+”，以未長(zhǎng)菌的最小濃度為最小殺菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)選

根據(jù)1.2.4.1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了最佳溶劑的選擇實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，不同溶劑的提取效果有很大差異。水、乙酸乙酯作為提取溶劑，提取液的抑菌圈直徑均大于30mm，20%乙醇、40%乙醇、80%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮提取液的抑菌圈直徑在20～30mm，60%乙醇、三氯甲烷、正丁醇提取液的抑菌圈直徑在10～20mm，石油醚提取液的抑菌圈直徑小于10mm。根據(jù)溶質(zhì)的相似溶原理，結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)才能易于混溶[12]，其中水提液的抑菌圈直徑最大，因此選擇水作為最佳溶劑。

圖1 溶劑對(duì)粗提液抑菌效果的影響Fig.1 Effects of different solvents on antifungal substances

2.2 提取溫度的優(yōu)選

用水作為提取溶劑，根據(jù)1.2.4.2的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了最佳提取溫度的選擇實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。隨著溫度增高，其抑菌效果逐漸提高，以提取溫度在80℃時(shí)，提取物的抑菌效果最好。所以選擇80℃作為最佳提取溫度。

圖2 不同提取溫度對(duì)提取液抑菌效果的影響Fig.2 Effects of different temperature on antifungal substances

2.3 提取時(shí)間的優(yōu)選

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)提取液抑菌效果的影響Fig.3 Effects of different time on antifungal substances

用水作為提取溶劑，提取溫度為80℃時(shí)，不同時(shí)間處理提取液的抑菌效果見圖3，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液的抑菌效果逐漸增高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2～3h時(shí)，抑菌效果最好。當(dāng)提取時(shí)間3～5h時(shí)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液的抑菌效果逐漸下降。所以，選擇3h作為最佳提取時(shí)間。

2.4 提取料液比的優(yōu)選

用水作為提取溶劑，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為3h，不同的料液比的提取液抑菌效果見圖4，當(dāng)料液比為1∶10～1∶15時(shí)，隨著提取溶劑的增加，提取液抑菌效果也逐漸增高；當(dāng)料液比在1∶20～1∶30時(shí)，抑菌效果趨于穩(wěn)定。提取溶劑的增加，使物料與溶劑的接觸面積增大，有效成分的浸出也隨之加快，抑菌活性增強(qiáng)[13]。所以，選擇1∶25作為最適宜的料液比。

圖4 不同料液比對(duì)提取液抑菌效果的影響Fig.4 Effects of different ratios on antifungal substances

2.5 提取次數(shù)

用水作為提取溶劑，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為3h，料液比1∶25。提取次數(shù)與提取液抑菌效果的關(guān)系見圖5，當(dāng)提取次數(shù)為1～2次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增多，抑菌效果也逐漸增高，可達(dá)33.2mm。當(dāng)提取次數(shù)為2～4次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，提取液的抑菌效果逐漸趨于平緩，所以選擇2次作為最適宜的提取次數(shù)。

圖5 不同提取次數(shù)對(duì)提取液抑菌效果的影響Fig.5 Effects of different times on antifungal substances

2.6 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)

在上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行最小抑菌濃度與最小殺菌濃度的實(shí)驗(yàn)，由表1可以看出，當(dāng)藥液濃度在15.7mg/mL時(shí)五號(hào)試管未渾濁，當(dāng)藥液濃度達(dá)到7.9mg/mL時(shí)六號(hào)試管出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。然后進(jìn)行最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)，當(dāng)藥液濃度在15.7mg/mL時(shí)有少量菌落。則表明五倍子粗提液對(duì)蕃茄晚疫病原菌的最小抑菌濃度為15.7mg/mL，最小殺菌濃度為31.3mg/mL。

表1 五倍子粗提液的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of MIC and MFC of antifungal substance

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)五倍子抗蕃茄晚疫病原菌有效成分提取條件的研究結(jié)果表明，五倍子提取液以水作為提取溶劑，在80℃回流提取3h，料液比為1∶25，最適宜的提取次數(shù)為2次時(shí)，五倍子提取液的抑菌效果最佳，在此條件下五倍子對(duì)番茄晚疫病菌的抑菌直徑為33.2mm。五倍子提取液對(duì)蕃茄晚疫病原菌最小抑菌濃度為15.7mg/mL，最小殺菌濃度為31.3mg/mL。由此可知，五倍子提取液的抑菌活性成分對(duì)蕃茄晚疫病原菌有較強(qiáng)的抑菌作用，為五倍子植物源殺菌劑的開發(fā)提供了良好理論的基礎(chǔ)。

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