固相萃取-超高效液相色譜法測定濃縮石榴汁中羥甲基糠醛含量

劉學(xué)芝，何 強(qiáng)，孔祥虹，杜寶中

（1.西安理工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，陜西西安710054；2.陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，陜西西安710068）

羥甲基糠醛（hydroxymethylfurfural，HMF）是葡萄糖、果糖等化合物在高溫或弱酸條件下脫水產(chǎn)生的醛類化合物，會(huì)使果汁的色值變小，口感變差，對人體有毒副作用[1]。濃縮石榴汁因其營養(yǎng)價(jià)值和保健作用越來越受到人們的歡迎，檢測濃縮石榴汁中羥甲基糠醛，對于評價(jià)石榴汁品質(zhì)和安全性具有重要意義。歐盟果蔬汁飲料工業(yè)協(xié)會(huì)（AIJN）規(guī)定果汁中羥甲基糠醛的最大殘留限量為20mg/L；國際果汁加工聯(lián)合會(huì)（IFFJP）建議濃縮果汁中最大殘留限量為25mg/L[2]。羥甲基糠醛的測定方法主要有液相色譜法[3-7]、紫外分光光度法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]等。但濃縮石榴汁中羥甲基糠醛的測定尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。由于石榴汁樣品基質(zhì)較復(fù)雜，采用常用的直接稀釋后測定方法[5-6]時(shí)存在干擾，本研究建立了一種利用新型聚合物固相萃取柱凈化，超高效液相色譜快速檢測濃縮石榴汁中羥甲基糠醛的方法，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲醇 均為色譜純，德國Merck公司；羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品 純度＞97%，美國Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水；濃縮石榴汁 均為果汁廠送檢樣品。

Acquity UPLC超高效液相色譜儀（配PDA檢測器）、UPLC HSS T3色譜柱（100mm×2.1mm，1.8μm）美國Waters公司；Milli-Q超純水制備儀 美國Millipore公司；IKA?VORTEX GENIUS 3渦旋混合器 德國IKA公司；50mL具塞塑料離心管 美國corning公司；Bond Elut ENV固相萃取柱 500mg，6mL，美國Agilent公司；0.22μm有機(jī)系微孔濾膜 天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 稱取2.5g（精確至0.01g）樣品置于50mL離心管中，加入20mL水，渦旋溶解。將Bond Elut ENV固相萃取柱依次用5mL甲醇、10mL水活化，將樣品溶液全部上樣，用5mL水洗滌離心管，洗滌液也合并上樣，待上樣液流至近干后，用5mL水淋洗，棄去全部流出液，用25mL甲醇-水溶液（2+8，V/V）洗脫，整個(gè)固相萃取凈化過程保持流速2～3mL/min，收集洗脫液，用超純水定容至50mL，過0.22μm微孔濾膜，待測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱取10mg（精確至0.1mg）羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中保存。

1.2.2.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 用乙腈-水（8+92，V/V）將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級稀釋，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的羥甲基糠醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中保存待用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（8+92，V/V），流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；樣品室溫度：15℃；檢測波長：285nm；進(jìn)樣量：10μL。標(biāo)準(zhǔn)溶液超高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of HMF standard

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

主要對色譜柱、流動(dòng)相進(jìn)行了考察，在色譜柱選擇時(shí)，比較了BEH C18、HSS T3兩種色譜柱，由于羥甲基糠醛的極性較大，在BEH C18色譜柱上出峰時(shí)間較早（1.5min左右出峰），而HSS T3色譜柱（2.0min左右出峰）填料上特殊的鍵合相更有利于極性化合物的保留，可顯著改善羥甲基糠醛的色譜保留及分離情況。在流動(dòng)相選擇時(shí)比較了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在比例相同時(shí)乙腈-水系統(tǒng)出峰較快，峰形較好，色譜分離也較好，最終選擇HSS T3色譜柱分離，乙腈-水（8+92，V/V）為流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的考察

濃縮石榴汁中主要含有糖、有機(jī)酸、色素、植物蛋白等物質(zhì)，直接稀釋進(jìn)樣測定時(shí)干擾大，而由于羥甲基糠醛極性大，采用液液萃取不能達(dá)到有效去除糖類物質(zhì)、有機(jī)酸等干擾成分的目的。C18、氨基等填料的固相萃取柱回收率分別為70%、62%，均不能有效的將羥甲基糠醛與基質(zhì)干擾雜質(zhì)有效去除，通過實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)Bond Elut ENV固相萃取柱的回收率（92%）與凈化效果良好，濃縮石榴汁樣品直接稀釋進(jìn)樣與經(jīng)Bond Elut ENV固相萃取柱凈化后進(jìn)樣見圖2，樣品凈化效果明顯。

圖2 濃縮石榴汁樣品凈化前后色譜圖Fig.2 Chromatogram of pomegranate juice concentrate

在確定采用Bond Elut ENV固相萃取柱凈化后，分別對上樣量、淋洗條件、洗脫條件進(jìn)行了考察。分別稱取濃縮石榴汁2.5、5.0、7.5g，每個(gè)質(zhì)量3個(gè)平行樣，均添加標(biāo)準(zhǔn)品100μg，結(jié)果表明，稱樣量為7.5g時(shí)的回收率（60%）明顯低于稱樣量為2.5、5.0g的回收率（92%、85%），分析可能是由于萃取柱的載樣量有限，稱樣量大時(shí)會(huì)造成萃取柱過載，使回收率降低。為確保測定結(jié)果準(zhǔn)確性，選擇稱樣量為2.5g。淋洗時(shí)選擇水為淋洗液，5mL水基本能夠把SPE小柱上的糖類、有機(jī)酸等極性大的物質(zhì)淋洗下來。洗脫時(shí)分別考察了體積比為10%、20%、30%的甲醇-水溶液，結(jié)果表明，三種比例的洗脫劑用量均為25mL時(shí)，20%、30%的甲醇-水溶液能夠?qū)⒅系牧u甲基糠醛洗脫完全，而10%的甲醇-水需要加大洗脫體積至35mL才能洗脫完全，而圖3反映了3種洗脫劑的洗脫效果，其中30%甲醇-水洗脫雜質(zhì)較多，10%和20%甲醇-水洗脫雜質(zhì)少，凈化效果較好。綜合考慮選擇20%甲醇-水作為洗脫劑。

圖3 不同洗脫劑凈化效果圖Fig.3 Chromatogram of sample purified by different elution

表1 濃縮石榴汁中羥甲基糠醛的加標(biāo)回收率和精密度數(shù)據(jù)（n=6）Table 1 Recoveries and precisions（RSDs）of 5-HMF in pomegranate juice concentrate（n=6）

2.3 線性和檢出限

將濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的羥甲基糠醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣檢測，以標(biāo)準(zhǔn)濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=23000X+2778.4（相關(guān)系數(shù)r=1.0000），在0.1～10.0mg/L范圍內(nèi)，羥甲基糠醛濃度與峰面積值有良好的線性關(guān)系。

以信噪比3（S/N=3）計(jì)算，羥甲基糠醛檢出限為0.02mg/L，以信噪比10（S/N=10）計(jì)算，羥甲基糠醛定量限為0.07mg/L。按1.2.1中樣品處理方法，濃縮石榴汁中羥甲基糠醛的檢出限為0.4mg/kg，定量限為1.4mg/kg。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

采用添加回收的方法，對濃縮石榴汁進(jìn)行加標(biāo)回收率測定，每個(gè)樣品添加3個(gè)水平，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，按規(guī)定的樣品凈化方法及超高效液相色譜檢測方法進(jìn)行測定，該方法的回收率及精密度數(shù)據(jù)如表1所示，3個(gè)加標(biāo)水平的回收率RSD均低于8.1%，滿足測定要求。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用所建立方法對16批濃縮石榴汁進(jìn)行測定，結(jié)果表明，這16批濃縮石榴汁中羥甲基糠醛含量在8.3～32.6mg/kg范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

羥甲基糠醛含量是評價(jià)果汁品質(zhì)的重要指標(biāo)，本文建立了采用Bond Elut ENV固相萃取柱凈化，UPLC法快速測定濃縮石榴汁中羥甲基糠醛。該方法準(zhǔn)確、簡便、快速，適用于濃縮石榴汁樣品中羥甲基糠醛的測定。

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