α-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)域突變提高選擇形成γ-環(huán)糊精能力

謝婷，岳洋，宋炳紅，鈔亞鵬，錢世鈞

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

3 北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191

環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶 (Cyclodextrin glycosyl transferase，CGTase) (EC 2.4.1.19) 是一種來(lái)自細(xì)菌的胞外酶，屬于 α淀粉酶家族 (家族 13)[1]。CGT酶能催化淀粉和其他α-1,4-葡聚糖生成非還原性的麥芽低聚糖即環(huán)糊精 (Cyclodextrins簡(jiǎn)稱 CDs)。

環(huán)糊精是由 6到多個(gè)葡萄糖單元以 (α-1,4)糖苷鍵相連的環(huán)狀低聚糖，3種主要類型是α-CD、β-CD 和 γ-CD[2-3]。環(huán)糊精的外緣 (Rim) 親水而內(nèi)腔 (Cavity) 疏水，因此與許多疏水客體化合物或功能基團(tuán)形成包合物從而改變其物理或化學(xué)性質(zhì)[4-5]。環(huán)糊精這種特性使其在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品、化學(xué)環(huán)保等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[6-10]。與 α-CD和 β-CD相比，γ-CD具有內(nèi)腔大，水溶性好，以及毒副作用小的特性，因此它在許多行業(yè)尤其食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有更大的潛在應(yīng)用[11]。但是現(xiàn)在市場(chǎng)上的環(huán)糊精主要是β-CD和部分 α-CD，γ-CD的低產(chǎn)量和高成本使得它的市場(chǎng)份額很小[12]。

目前已有的野生 CGT酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物都是 3種 CD的混合物，并以主要產(chǎn)物命名為 α-，β-和γ-CGT酶[13]。其中γ-CGT酶種類很少，而且環(huán)化能力有限，如克氏芽胞桿菌Bacillus clarkiistrain 7364的γ-CGT酶降解糊化淀粉生成環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率為13.7%，γ-CD產(chǎn)量最高為0.8 g/L[14-15]。

因此，對(duì) CGT酶進(jìn)行突變改造以期提高其催化形成γ-CD的能力是該領(lǐng)域重要研究方向之一。序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析表明，α/β-CGT酶和γ-CGT酶在決定產(chǎn)物選擇性的位點(diǎn)主要有兩處不同，分別是-7亞位點(diǎn) (145-152) 和-3亞位點(diǎn)(47) (按照環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans251 CGT 酶的序列順序)。在 α/β-CGT 酶中分別是SSTDPSFA/SSDQPSFA (-7) 和 K/R (-3)，而在γ-CGT 酶中分別是 DI (-7) 和 T (-3)[14–15]。-3 亞位點(diǎn)的改造有來(lái)自芽胞桿菌Bacillussp. G1的β-CGTase，在發(fā)生 K43T (對(duì)應(yīng)Bacillus circulans251 β-CGT酶的47位) 突變后，γ-CD的比例從10%提升至 39%[16]。針對(duì)-7亞位點(diǎn)的改造有來(lái)自B. circulansstrain 8的 β-CGT酶，其145～151位氨基酸突變?yōu)锳sp后γ-CD的產(chǎn)量提高1倍[17]。同時(shí)來(lái)自B. clarkii7364的γ-CGT酶的142位Asp突變?yōu)棣?CGT酶中保守的6個(gè)氨基酸后，γ-CD降低了63.5%，而α-CD和β-CD分別提高了28.8%和 34.8%，證明-7亞位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)物選擇性十分重要[18]。針對(duì)195位的改造有Bacillus circulans251 β-CGT酶的突變體Y195L，其產(chǎn)物中α-CD由13%降為0，β-CD由64%增加到86%，γ-CD則由23%降低到14%，即β-CD的產(chǎn)物選擇性有所提高，γ-CD 的選擇性有所下降[19]。以上研究大都是基于對(duì)β-CGT酶進(jìn)行的改造。以α-CGT酶為材料向γ-CGT酶的改造，使其產(chǎn)物選擇性由六元環(huán)的 α-CD直接向八元環(huán)的 γ-CD轉(zhuǎn)移，而不是七元環(huán)的β-CD，這在已往尚未見(jiàn)報(bào)道，而且對(duì)于進(jìn)一步揭示環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶催化的分子機(jī)理、定向改造酶蛋白的催化選擇性具有借鑒意義。

本研究以源于軟化芽胞桿菌Paenibacillus maceranssp. 602-1的一種α-CGT酶為材料，通過(guò)比對(duì) 3種酶蛋白的序列異同，以及已有對(duì)β-CGT酶的改造經(jīng)驗(yàn)，確定若干可能有助于形成γ-CD的潛在位點(diǎn)。本文擬對(duì)這些位點(diǎn)或區(qū)域進(jìn)行如下改造：K47T (-3亞位點(diǎn))，Y195I (環(huán)化中心)，146位以異亮氨酸取代146～152的6個(gè)氨基酸 (簡(jiǎn)寫為△6，-7亞位點(diǎn))，以探討這些位點(diǎn)對(duì)α-CGT酶產(chǎn)物特異性的影響。為從蛋白結(jié)構(gòu)層面揭示 CGT酶的產(chǎn)物選擇性的影響因素，以及實(shí)現(xiàn)γ-CGT酶的人工改造提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

表達(dá)宿主菌E. coliBL21(DE3) 和克隆宿主菌E. coliDH5α購(gòu)自全式金公司(北京)；pET-22b/cgt由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保藏；表1中列出了本實(shí)驗(yàn)中所用到的菌株和質(zhì)粒。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 試劑

Taq聚合酶和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司(北京)。T4多聚核苷酸激酶，TaqDNA連接酶和DpnⅠ購(gòu)自NEB公司。Ni-NTA鎳親和層析柱和凝膠層析柱S-100購(gòu)自GE Healthcare。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自 Fermentas，引物合成及測(cè)序由擎科興業(yè)公司 (北京) 完成。其他的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 突變方法

以 pET-22b/cgt質(zhì)粒為模板進(jìn)行突變，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物 (表2)，突變引物用T4多聚核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化，突變 PCR體系如下：10×Taq緩沖液 2.5 μL，Taq酶 1 μL，10×TaqDNA 連接酶緩沖液 2.5 μL，TaqDNA 連接酶0.5 μL，磷酸化引物 1 μL，DpnI 1 μL，模板 2 μL，用 ddH2O 補(bǔ)至 50 μL。PCR 擴(kuò)增條件：65 ℃5 min；95 2 min℃ ，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，65 ℃8 min，30個(gè)循環(huán)；75 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物加入DpnⅠ酶37 ℃反應(yīng)1 h。PCR合成雙鏈擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，共2個(gè)循環(huán)。

突變酶△6的構(gòu)建按照TaKaRa MutanBEST Kit的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物加入 1/10體積的3 mol/L的醋酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，?20 ℃過(guò)夜。沉淀產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB平板上培養(yǎng)，從平板上挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，測(cè)序分析突變結(jié)果。正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3)，挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基，保存菌種。

1.3 培養(yǎng)條件

從平板上挑取單菌落接入裝有 5 mL LB培養(yǎng)基 (含 100 μg/mL 氨芐青霉素) 中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng) 12 h。將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按 2%(V/V) 的接種量，接種至裝有50 mL TB培養(yǎng)基(含 100 μg/mL氨芐青霉素) 中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌體至OD600為0.6～0.8時(shí)冰上冷卻，添加IPTG至終濃度0.01 mmol/L。轉(zhuǎn)至16 ℃搖床，24 h后加入氯化鈣和甘氨酸至終濃度分別為20 mmol/L和150 mmol/L繼續(xù)誘導(dǎo)72 h。

1.4 突變酶Y195I的純化

將發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心30 min，上清液先經(jīng) 20% (W/V) 硫酸銨沉淀 6 h，12 000 r/min離心除去部分雜蛋白，再經(jīng) 70%(W/V) 硫酸銨沉淀過(guò)夜。12 000 r/min離心，沉淀物用適量緩沖液 A (10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，pH 7.0) 溶解，并在緩沖液A中透析過(guò)夜。12 000 r/min離心除去不溶沉淀，得到鎳柱親和層析的上樣樣品。鎳親和柱用緩沖液A平衡后上樣，然后分別用緩沖液A、B (20 mmol/L咪唑，50 mmol/L Na2HPO4，300 mmol/L NaCl，pH 7.0)、C (300 mmol/L咪唑，50 mmol/L Na2HPO4，300 mmol/L NaCl，pH 7.0) 洗脫，分步收集。含 CGT酶的組分用聚丙烯酰胺葡聚糖S-100凝膠層析進(jìn)一步純化，以緩沖液 D(10 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L NaH2PO4，pH 6.5) 進(jìn)行洗脫，含CGT酶的組分超濾濃縮。純化后的野生和重組CGT酶在?80℃保存。

表2 定點(diǎn)突變引物序列Table 2 Primers used in the site directed mutagenesis

1.5 酶活力和蛋白測(cè)定

酶活力測(cè)定參考淡家林等的方法進(jìn)行[20]。0.2%菱糊牌可溶性淀粉 0.4 mL，40 ℃預(yù)熱15 min，加入適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL，對(duì)照在加酶之前加入 1.5 mL 0.1 mol/L HCl，40 ℃保溫10 min，樣品管加入 1.5 mL的HCl終止反應(yīng)。樣品管和對(duì)照管分別加入3 mL 1 mol/L I2-KI及5 mL H2O搖勻，700 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。在上述條件下，每分鐘減低10%吸光度所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

蛋白含量的測(cè)定方法根據(jù) Bradford[21]的方法進(jìn)行，使用牛血清蛋白 (BSA) 作為標(biāo)準(zhǔn)品。

用 12%分離膠和 5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE[22]對(duì)酶蛋白的表達(dá)和純化情況進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。

1.6 環(huán)糊精生成能力和產(chǎn)物選擇性分析

以1% (W/V) 可溶性淀粉作為底物，1 g淀粉溶解在 90 mL 100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5) 中，定容至100 mL，煮沸10 min。以400 U/g淀粉比例加入野生酶和突變酶，置于40 ℃、150 r/min搖床中反應(yīng)50 h，隔一定時(shí)間取樣。樣品于 12 000 r/min離心 30 min，上清0.45 μm超濾膜過(guò)濾后取20 μL上機(jī)分析。采用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物分析的條件是：Waters 600 HPLC色譜儀，Waters手動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Lichrosorb NH2(4.6 mm×150 mm)，Waters 2414示差檢測(cè)器；流動(dòng)相 (V/V) 為 70%乙腈水溶液，流速1 mL/min；柱溫 40 ℃。分別制作 α-CD、β-CD和 γ-CD的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各環(huán)糊精的實(shí)際產(chǎn)量。

1.7 突變體酶蛋白建模

將野生和突變 CGT酶序列發(fā)送至SWISS-MODEL蛋白建模工作站(http://swissmodel.expasy.org/workspace)，理論結(jié)構(gòu)通過(guò)同源模擬獲得[23-25]。

1.8 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

取適量稀釋后的酶液分別在 30～80 ℃的水浴中與底物反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活力，以確定其最適反應(yīng)溫度。取適量酶液分別在30～80 ℃的水浴中保溫30 min，測(cè)定剩余酶活以確定酶的熱穩(wěn)定性。

取適量稀釋后的酶液分別在 50 ℃水浴、pH 3～10的pH條件下與底物反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活力，確定其最適作用pH。取適量酶液在4 ℃、不同pH條件下保溫16 h，測(cè)定剩余酶活以確定酶的pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變酶基因獲得和異源表達(dá)

以野生型質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含突變基因的質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，目標(biāo)位點(diǎn)正確突變。將pET-22b(+) 質(zhì)粒，野生酶和突變酶重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)，挑取陽(yáng)性克隆。經(jīng)驗(yàn)證后的突變重組菌在TB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，收集發(fā)酵上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析。以E. coliBL21/pET-22b(+) 空載體表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照，從電泳圖譜的結(jié)果可以看出有明顯的目的條帶，分子量約為75 kDa (圖1)，說(shuō)明目的蛋白得到了有效的表達(dá)。對(duì)突變 CGT酶的粗酶液活力和比活力進(jìn)行分析，初步確定突變酶的淀粉水解能力都有所下降 (表3)。

2.2 突變體酶的環(huán)糊精生成能力和選擇性分析

轉(zhuǎn)化體系含1%的可溶性淀粉，突變酶粗酶液 40 ℃轉(zhuǎn)化 24 h后，測(cè)定 α-，β-和 γ-CD的含量 (表4)。突變酶K47T和野生酶的環(huán)糊精產(chǎn)量相似，都是4 g/L左右，其他兩種突變酶的環(huán)糊精量有不同程度的下降。

突變酶K47T的α-CD由68.9%降為57.1%，β-CD和γ-CD分別由22.2%和8.9%增加為31%和11.9%。可見(jiàn)47位的突變使得β-和γ-CD產(chǎn)量和產(chǎn)物比例提高，但是提高的幅度不大，α-CD仍然是主要產(chǎn)物。

突變酶Y195I的CD總產(chǎn)量下降了約30%，為3 g/L。其中，α-CD由68.9%降為30%，β-CD由 22.2%提高到 33.3%；γ-CD由 8.9%增加到36.7%，成為主要產(chǎn)物，生成量達(dá)到1.1 g/L，是野生酶 (0.4 g/L) 的3倍。可見(jiàn)該195位的突變對(duì)CD產(chǎn)量和產(chǎn)物選擇性影響顯著。

突變酶△6導(dǎo)致總 CD產(chǎn)量下降 54%，為2.1 g/L，α-CD由 68.9%降為 47.6%，仍是主要產(chǎn)物，β-和 γ-CD分別由 22.2%和 8.9%增加為33.3%和19.0%。

圖1 野生酶和突變酶的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of the crude enzymes of the wild-type and the mutant CGTases. M: protein marker; 1: negative control (pET-22b); 2: WT; 3: K47T;4: Y195I; 5: △6; 6: Y195I/△6; 7: K47T/Y195I.

表3 野生和突變CGT酶活力分析Table 3 Enzymatic and specific activities of the wild-type and the mutant CGTases

由此可見(jiàn)，突變酶Y195I具有了與野生CGT酶明顯不同的催化選擇性特征，特別是由以六元環(huán) α-CD為主產(chǎn)物直接過(guò)渡到八元環(huán) γ-CD為主產(chǎn)物，而不是七元環(huán) β-CD，這在已有研究中未見(jiàn)報(bào)道。另外，雖然在β-/γ-CGT酶突變研究中，-3亞位點(diǎn)和-7亞位點(diǎn)對(duì) γ-CD的形成有重要作用，但對(duì) α-CGT酶做類似的突變后并未發(fā)現(xiàn)有同樣的效果，即γ-CD在產(chǎn)物中的地位沒(méi)有顯著改變。這也暗示3種酶活性域中的對(duì)應(yīng)亞位點(diǎn)的功能可能并不完全相同。為此，進(jìn)一步構(gòu)建了雙突變酶 K47T/Y195I和 Y195I/△6，以觀察對(duì)形成γ-CD的選擇性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙突變酶K47T/Y195I和 Y195I/△6的淀粉水解能力比單突變體酶進(jìn)一步降低，轉(zhuǎn)化能力很弱，研究的意義不大。

表4 野生和突變CGT酶轉(zhuǎn)化可溶性淀粉結(jié)果Table 4 Conversion of soluble starch with the wild-type and the mutant CGTases

2.3 突變酶Y195I的酶學(xué)性質(zhì)

野生酶和突變酶 Y195I的粗酶液經(jīng)鎳柱親和層析和凝膠過(guò)濾層析純化后，得到電泳純蛋白(圖 2)。

野生酶和突變酶的最適反應(yīng)溫度都是60 ℃，當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)酶活力下降顯著 (圖3A)。在 20 ℃、30 ℃和 40 ℃保溫 16 h后兩者保留了50%以上的活力，保存溫度高于40 ℃后酶活顯著下降 (圖3B)。

野生酶和突變酶的最適反應(yīng) pH分別是 5.0和 6.0 (圖 3C)，并且都在 pH 6.5最穩(wěn)定 (圖 3D)，突變酶在 pH 6.0～7.5的范圍內(nèi)保留了 60%以上的活力。而野生酶在pH 6.0和7.5時(shí)酶活力不足50%，說(shuō)明突變酶比野生酶具有更好的pH穩(wěn)定性。

圖2 純化后野生和突變CGT酶的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type and mutant CGTases. M: protein marker; 1: wild-type;2: mutant Y195I.

圖3 野生酶和突變酶Y195I的酶學(xué)性質(zhì) (A) 最適溫度 (B) 溫度穩(wěn)定性 (C) 最適pH (D) pH穩(wěn)定性Fig. 3 Characteristics of the wild-type and mutant Y195I CGTases. (A) The effect of temperature on enzyme activities. (B) Thermostability of the enzymes. (C) The effect of pH on enzyme activities. (D) The pH stability of the enzymes. All experiments were performed in triplicate.

純化的野生酶和突變酶Y195I在40 ℃水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精實(shí)驗(yàn)，從圖4可以看到環(huán)糊精量在反應(yīng)30 h后達(dá)到最大。從圖4A可知，野生酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精中 α-CD、β-CD和γ-CD之比為7.7:2.5:1，α-CD是主要產(chǎn)物。而突變酶 Y195I的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 α-CD、β-CD和 γ-CD之比為1:1.1:1.2 (圖4B)，γ-CD成為了主要產(chǎn)物，突變酶的催化選擇性發(fā)生了很大的轉(zhuǎn)變，產(chǎn)物中γ-CD的產(chǎn)量大大提高。但相對(duì)于野生酶，突變酶的總轉(zhuǎn)化率從4.5 g/L降至3 g/L。

2.4 作用機(jī)理分析

根據(jù) SWISS-MODEL模擬的三維結(jié)構(gòu)模型可以看到，突變酶 Y195I的催化中心沒(méi)有因?yàn)?95位氨基酸的變化而發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)變化(圖5C)，故可以認(rèn)為突變酶特性的一系列改變不是由空間結(jié)構(gòu)變化直接導(dǎo)致。突變酶環(huán)糊精的總生成量下降可能因?yàn)?95位的芳香族氨基酸Try比 Ile更有利于形成環(huán)糊精；其次 195位的 Tyr可以排斥活性中心的水分子從而減少水解反應(yīng)但增加環(huán)化反應(yīng)。催化選擇性的變化可能是195位氨基酸的側(cè)鏈類型影響產(chǎn)物環(huán)糊精的大小[11]。當(dāng) Tyr突變?yōu)?Ile后，195位氨基酸的側(cè)鏈變短(圖5C)，原來(lái)Tyr位于催化中心的中軸作用被削弱，主要產(chǎn)物變成 γ-CD。突變酶 K47T的 β和γ-CD比例都有所升高，但α-CD仍是主要產(chǎn)物。從圖5B看到47位賴氨酸被蘇氨酸取代后-3位點(diǎn)處的空腔有所增大，更有利于β-和γ-CD的形成。突變酶△6的 β和 γ-CD比例也有所升高，可能是因?yàn)楫惲涟彼彷^小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得底物結(jié)合凹槽空間變大，從而為較長(zhǎng)葡萄糖鏈的結(jié)合提供了足夠的空間，一定程度上更適合β-和γ-CD的生成。

圖4 野生型 (A) 和突變 (B) CGT酶分別作用于1% (W/V) 可溶性淀粉的環(huán)糊精形成過(guò)程Fig. 4 Courses of formation of CDs from 1% (W/V) soluble starch by the wild-type and mutant Y195I CGTases. (A)Wild-type CGTase. (B) Mutant Y195I CGTase.

圖5 野生酶和突變酶模擬結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig. 5 Structure model alignment of the wild-type and mutant CGTases combined with glycosaminoglycan chain. (A)WT. (B) K47T. (C) Y195I. (D) △6.

可見(jiàn)，-3和-7亞位點(diǎn)對(duì)軟化類芽胞桿菌的α-CGT酶的催化選擇性有一定的影響，使 β和γ-CD比例提高，但是并沒(méi)有達(dá)到改變催化選擇性的效果。而在突變酶 Y195I的 CD產(chǎn)物中α-CD的比例由 68%降至 30%，γ-CD的比例達(dá)到36.7%，產(chǎn)物催化選擇性發(fā)生了顯著改變。有趣的是來(lái)自B. subtilisstrain 313的γ-CGT酶是已報(bào)道唯一的195位是Leu的CGT酶。所以Y195I的突變對(duì)于 α-CGT酶的催化選擇性機(jī)理研究具有重要意義。

3 結(jié)論

酶蛋白活性區(qū)域 195位氨基酸對(duì)于 α-CGT酶的活力和催化選擇性具有重要作用。當(dāng)195位Tyr突變?yōu)镮le時(shí)產(chǎn)物選擇性發(fā)生了徹底的轉(zhuǎn)變，主要產(chǎn)物由 α-CD轉(zhuǎn)變成為 γ-CD，因此突變酶Y195I具有生產(chǎn) γ-CD的潛力。突變酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性與野生酶相似，pH穩(wěn)定性較野生型更好。而-3和-7亞位點(diǎn)對(duì) α-CGT酶的催化選擇性的影響并不顯著。下一步工作將通過(guò)對(duì)突變酶晶體的結(jié)構(gòu)解析進(jìn)一步揭示其產(chǎn)物選擇性變化的機(jī)理。

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