高效液相色譜－蒸發(fā)光散射測定瓜蔞中L－瓜氨酸的含量

李愛峰，柳仁民，張永清

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355;2.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城252000)

瓜蔞為葫蘆科栝樓屬植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim.)和雙邊栝樓(Trichosanthes rosthorinii Harms)的干燥成熟果實(shí)，具有清熱滌痰、寬胸散結(jié)、潤燥滑腸之功效，用于治療肺熱咳嗽、痰濁黃稠、胸痹心痛、結(jié)胸痞滿、乳癰、肺癰、腸癰、大便秘結(jié)等癥［1］。除了其重要的藥用價值，瓜蔞在保健食品［2］、日用化工［3］等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。L－瓜氨酸(L－citrulline)是首先從西瓜汁中發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于葫蘆科植物的果實(shí)中。L－瓜氨酸可以防治前列腺疾病、提高男性性功能，治療L－精氨酸缺乏引起的相關(guān)疾病，具有促進(jìn)血液循環(huán)、保護(hù)心血管、改善微循環(huán)、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、提高運(yùn)動員肌肉力量與耐力及護(hù)膚去斑等重要作用［4］。目前，L－瓜氨酸的分析方法主要有氨基酸自動分析儀法、酶法［5］、比色法［6］、薄層掃描法［7］、高效液相色譜法［8］及質(zhì)譜法［9］。在上述方法中，氨基酸分析儀法、酶法和質(zhì)譜法價格昂貴，薄層掃描法和比色法的準(zhǔn)確度、靈敏度都不高，而高效液相色譜法由于其分離效率高、分析速度快、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)已成為氨基酸分析中最為有效的手段之一。由于L－瓜氨酸無紫外吸收，因此通常需要柱前衍生化處理，經(jīng)常出現(xiàn)衍生物不穩(wěn)定、步驟繁瑣、操作時間長、試劑毒性強(qiáng)等問題。蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一種新的通用型、質(zhì)量型檢測器，特別適用于無紫外吸收的物質(zhì)的檢測，已廣泛用于氨基酸的檢測［10－12］。本文建立了HPLC－ELSD法測定L－瓜氨酸的實(shí)驗(yàn)方法，并用于實(shí)際樣品的測定，該法簡單、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為瓜蔞中L－瓜氨酸的定量分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L－瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度大于99.0%，美國Sigma公司;0.45μm微孔濾膜 浙江海寧市正興特種過濾設(shè)備制造有限公司;鹽酸為分析純 濟(jì)南試劑總廠;實(shí)驗(yàn)用水為自制去離子水;瓜蔞藥材 購于當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

Unimicro HPLC泵及色譜工作站 通微(上海)分析技術(shù)有限公司;Attech ELSD2000ES蒸發(fā)光散射檢測器 美國奧泰公司;WK－1000A高速藥物粉碎機(jī) 青州市精誠機(jī)械有限公司;AR－1104的電子天平 奧克斯國際貿(mào)易上海有限公司;KQ3200型超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司。

1.2 色譜分離與檢測條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB－Aq柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm);流動相:水;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:室溫;漂移管溫度:115℃;空氣流速:3.2L/min，分流閥狀態(tài):關(guān)。

1.3 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取L－瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品100mg，用水溶解后定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水定容，搖勻，該溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。準(zhǔn)確移取上述溶液1、2、3、4、5mL分別置于10mL容量瓶中，用水定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

精確稱取瓜蔞樣品適量，粉碎，以10倍量的鹽酸水溶液(10－4mol/L，pH4.0)超聲提取 3次，每次0.5h，過濾，合并提取液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

由于L－瓜氨酸是水溶性氨基酸，因此首先以水為提取溶劑考察了不同的提取方法(冷浸、超聲及加熱回流提取)對于提取效率的影響，結(jié)果表明超聲提取的效率最高，而且具有提取時間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。采用超聲提取法，考察了提取溶劑的pH(2.0、4.0、6.0、8.0)對于提取效率的影響，表明當(dāng)pH為4.0時提取效率最高。這是由于L－瓜氨酸的等電點(diǎn)為pH5.97［13］，當(dāng)提取溶劑的 pH 為 6.0 時，L－瓜氨酸的靜電荷幾乎為零，此時水溶性最差，提取效率亦最低，當(dāng)提取溶劑的pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時，L－瓜氨酸以離子形式存在，水溶性增強(qiáng)，提取效率亦提高。而在堿性條件下，瓜蔞中的多糖類物質(zhì)易發(fā)生糊化，增加過濾時的難度。此外，還考察了料液比、超聲時間及次數(shù)對于提取效率的影響，結(jié)果表明料液比為1∶10，超聲提取3次，每次0.5h即可提取完全。

2.2 色譜條件的選擇

為了選擇合適的色譜柱，實(shí)驗(yàn)考察了L－瓜氨酸在普通 C18柱、C30柱、YMC ODS－A 柱及 Agilent ZORBAX SB－Aq柱上的保留情況，結(jié)果表明其在上述前三種色譜柱上幾乎沒有保留，保留時間僅為2min，而在Agilent ZORBAX SB－Aq柱上有較強(qiáng)的保留，可能是由于L－瓜氨酸的極性太強(qiáng)所致。使用Agilent ZORBAX SB－Aq柱，考察了流動相的組成對于分離效果的影響，結(jié)果表明甲醇或乙腈的比例越大，L－瓜氨酸的保留時間越短，與其他強(qiáng)極性物質(zhì)之間的分離度越差，當(dāng)以水作為流動相時，L－瓜氨酸與其他組分之間的分離效果良好，保留時間也令人滿意(如圖1所示)。

圖1 L－瓜氨酸對照品(A)及供試品溶液(B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of L－citrulline reference substance(A)and the sample solution(B)

2.3 ELSD參數(shù)的選擇

漂移管的溫度和載氣的流速直接影響ELSD檢測器的響應(yīng)，隨著漂移管的溫度升高，流動相蒸發(fā)趨于完全，噪音減小，信噪比提高，但溫度過高則會使流動相沸騰，噪音增大，甚至?xí)?dǎo)致組分部分汽化，響應(yīng)值變小;載氣的流速越小，流動相蒸發(fā)后形成的溶質(zhì)顆粒越大，散射光的強(qiáng)度越大，響應(yīng)值越大，但流速太小會使流動相蒸發(fā)不完全，噪音增大，信噪比降低。分別改變漂移管的溫度和載氣的流速，觀察噪音和響應(yīng)信號的大小，發(fā)現(xiàn)當(dāng)漂移管的溫度為115℃，載氣的流速為3.2L/min，分流閥關(guān)時基線平穩(wěn)，信噪比最高。

2.4 線性關(guān)系考察

分別取不同濃度的對照品溶液20μL進(jìn)樣分析，由色譜工作站處理數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度(μg/mL)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得L－瓜氨酸的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測得L－瓜氨酸的檢出限，列于表1中。

表1 L－瓜氨酸的回歸方程、線性范圍和檢出限Table 1 Regression equation，linear range and detection limit of L－citrulline

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取L－瓜氨酸對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL，分別測定峰面積和保留時間，計(jì)算保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分別為0.27%和0.36%，表明該法精密度良好(見表2)。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision test

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取L－瓜氨酸對照品溶液，每隔4h進(jìn)樣分析一次，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，分別測定峰面積和保留時間，計(jì)算峰面積及保留時間的 RSD分別為0.84%和0.23%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定(見表3)。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability test

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

在已知L－瓜氨酸含量的瓜蔞樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.4中的制備方法制備后進(jìn)樣分析，平行測定5次，按照外標(biāo)法定量并計(jì)算回收率，樣品加標(biāo)回收率均為98.36%，RSD為1.77%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery test

2.8 樣品測定結(jié)果

使用該方法對市售的瓜蔞樣品中L－瓜氨酸的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果Table 5 Determination result of samples

3 結(jié)論

本文建立了HPLC－ELSD測定L－瓜氨酸的實(shí)驗(yàn)方法，對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明該法簡單、準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，適用于瓜蔞中L－瓜氨酸的含量測定，使用本方法對市售的四個不同產(chǎn)地瓜蔞樣品中L－瓜氨酸的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明其含量為0.1mg/g左右。

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