轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的研究

凌 莉，劉靜宇，易敏英，吳少云，劉 津，蔡 穎，李志勇，高東微，*

(1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州510623;2.華南理工大學(xué)，廣東廣州510640;3.汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭515031)

轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt176是最早的轉(zhuǎn)基因作物品種之一，1995年由瑞士先正達(dá)公司研發(fā)，具有抗蟲特性。1995～2004年間，美國、加拿大、日本、荷蘭、歐盟、阿根廷、澳大利亞、南非、韓國、菲律賓和臺灣相繼批準(zhǔn)了Bt176玉米作為食品或飼料的原料進行加工和銷售。我國于2004年批準(zhǔn)Bt176玉米作為食品或飼料的原料進行加工和銷售。根據(jù)國務(wù)院《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》［1］、農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》［2］和國家質(zhì)檢總局《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》［3］等的轉(zhuǎn)基因管理政策，我國明確規(guī)定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品申報和符合性檢驗管理制度，對進口農(nóng)食產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的品系鑒別檢測提出了技術(shù)要求。這為建立品系檢測方法和開展品系檢驗監(jiān)管提供了法規(guī)依據(jù)。目前，國內(nèi)現(xiàn)行轉(zhuǎn)基因玉米Bt176的品系特異性檢測方法標(biāo)準(zhǔn)有2項，分別是《SN/T 1196－2003玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性 PCR 檢測方法》［4］和《NYB869HGG－8Y2007 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種定性PCR方法》［5］。這2項標(biāo)準(zhǔn)均采用普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的技術(shù)。國外普遍認(rèn)可和采用基于TaqMan實時熒光PCR技術(shù)的歐盟官方檢測方法“Event－specific Method for the Quantification of Maize Bt176 Using Real－time PCR”［6］。我國轉(zhuǎn)基因監(jiān)管檢驗的實際工作中，上述標(biāo)準(zhǔn)方法均存在一定的技術(shù)局限性，其中普通PCR是初篩檢測技術(shù)，操作繁瑣，容易發(fā)生交叉污染，且靈敏度較低;實時熒光PCR則需要依賴大型儀器設(shè)備，成本昂貴，難以在基層實驗室普及應(yīng)用。因此，目前急需建立一種成本低廉、快速、簡便而且靈敏度高的檢測方法，滿足我國大宗糧谷和飼料進出口日常檢驗監(jiān)管和快速通關(guān)的需要。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增［7］(LAMP，Loop－mediated Isothermal Amplification)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)明的一種新型核酸片段擴增技術(shù)，具有高特異性、高靈敏度、操作簡便、結(jié)果判讀簡單和成本低廉的特點。目前LAMP檢測技術(shù)已在食品安全、生物安全、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［8－12］，在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域也開展了對大豆、玉米等轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測方法［13－16］，并已成為出口食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法之一［17］。本文通過優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)和反應(yīng)條件最終建立的轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt176的品系特異性LAMP檢測方法靈敏、快速、操作簡便，是轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測的一種有益補充手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米(M20、M21、M22、W7731、W5599、A155、A103、W7845、W8272)、玉米酒糟粕(YP1、YP10、W5544、W5545)、豆粕(262、118、313) 均來自于進出口商品;玉米 Bt176(5%)、大豆 GTS40－3－2(10%)均為IRMM?標(biāo)準(zhǔn)品;玉米MIR604(100%)、GA21(100%)、MON89034(100%)、大豆MON89788(100%)均為 AOCS?標(biāo)準(zhǔn)品;玉米MON810(10%)、98140(10%)、大 豆 DP356043(10%)、DP305423(10%)均為 ERM?標(biāo)準(zhǔn)品;Promega Wizard?基因組DNA純化試劑盒 北京盈田卓越科技有限公司;Ex Taq、dNTPs 寶生物工程(大連)有限公司;甜菜堿、Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol緩沖液 Sigma公司;1000×SYBR GreenⅠ 廈門百維信生物科技公司。

實時濁度儀LA－320C 日本LOOPAMP;NANODROP 1000核酸蛋白分析儀 美國THERMO SCIENTIFIC;ABI 7900實時熒光定量PCR儀 美國ABI;恒溫金屬浴 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取與質(zhì)量分析 按GB/T 19495.3－2004［18］規(guī)定，實驗樣品均采用CTAB法提取植物基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀測定DNA的純度和濃度后稀釋DNA溶液到100ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)玉米Bt176品系特異靶序列，采用LAMP專用引物設(shè)計軟件設(shè)計3套LAMP引物，由上海生工生物工程有限公司合成，純度為色譜級。

1.2.3 LAMP方法的建立 初步確定25μL的LAMP反應(yīng)體系，其成分包括:1×ThermoPol緩沖液、外引物F3和 B3各 0.2μmol/L、內(nèi)引物 FIP和 BIP各1.6μmol/L、環(huán) 狀 引 物 LF 和 LB 各 0.8μmol/L、1.4mmol/L dNTPs、0.8 mol/L 甜菜堿、6mmol/L MgSO4、0.32U/μL Bst DNA 聚合酶、DNA 模板200ng。

參照LAMP濁度儀使用說明書，將混合物置于反應(yīng)孔中，在反應(yīng)管中加入1滴石蠟油，管蓋內(nèi)壁加入1μL 0.1%的SYBR GreenⅠ。然后將其置于65℃恒溫反應(yīng)60min，最后80℃滅活5min結(jié)束反應(yīng)。濁度儀實時觀察反應(yīng)管中是否發(fā)生擴增，如果發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，濁度增加，濁度儀上會出現(xiàn)相應(yīng)的峰段。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管蓋內(nèi)壁的SYBR GreenⅠ離心，觀察反應(yīng)管中液體顏色，進一步驗證是否發(fā)生擴增反應(yīng)，如發(fā)生擴增，溶液為綠色，否則保持SYBR GreenⅠ橙色不變。

1.2.4 LAMP引物的篩選 用5%的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，0%的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176作為陰性對照，每組對照分別設(shè)置4個平行，進行LAMP反應(yīng)。通過觀察實時濁度儀的峰圖結(jié)果，根據(jù)起始擴增時間、濁度變化和濁度曲線的重復(fù)性等指標(biāo)對引物進行篩選。

1.2.5 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 選取反應(yīng)溫度61、63、65、67℃單個變量參數(shù)，進行單因素變化實驗，對LAMP反應(yīng)條件進行優(yōu)化。根據(jù)實時濁度儀觀察實驗結(jié)果，選擇最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.6 靈敏度實驗 為確定本方法的檢測靈敏度，采用不同梯度濃度(0%、0.1%、0.5%、1%、5%)的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176標(biāo)準(zhǔn)品進行LAMP擴增，每個濃度設(shè)置2個平行，用實時濁度儀進行監(jiān)測，并加入1000×SYBR Green I觀察顏色。

1.2.7 特異性實驗 采用轉(zhuǎn)基因玉米Bt176以外其他轉(zhuǎn)基因玉米品系的標(biāo)準(zhǔn)品、轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品、含有Bt176的進口玉米商品和其他植物及其加工產(chǎn)品對本實驗設(shè)計的引物進行特異性實驗，用實時濁度儀監(jiān)測結(jié)果，并加入1000×SYBR Green I觀察顏色。

1.2.8 穩(wěn)定性實驗 用5%的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176標(biāo)準(zhǔn)品的DNA添加到非轉(zhuǎn)基因玉米DNA中制成模擬樣品DNA進行檢測，添加量為5%、1%、0.5%、0%，每個模擬樣品DNA重復(fù)20次。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP引物的篩選

根據(jù)玉米Bt176品系特異靶序列設(shè)計3套LAMP引物，用5%的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進行引物的初步篩選，通過LAMP反應(yīng)實時濁度儀結(jié)果顯示，第1、2套引物沒有發(fā)生擴增反應(yīng);第3套引物發(fā)生了擴增反應(yīng)，出峰時間為37min左右，峰高為0.15，出峰時間和峰高值適中，可用于建立LAMP檢測方法，并應(yīng)當(dāng)進一步優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)。

第3套引物的序列分別為:

外引物1(F3):TTAGGGACGTGGGTTTGGTCC;

外引物2(B3):GCGGAAGATCCGAGAAGAG;

內(nèi)引物1(FIP):CCAATCAAGGCCATTGACCG AGATCTGATGTTCTCGAAT;

內(nèi)引物2(BIP):GCCAAATCTCTCTCCCTCTCAT GTGGGAGGGAGCTTCTC;

環(huán)狀上游引物(LF):GGATTCGTGCATC AATAGG;

環(huán)狀下游引物(LB):TCCCCCTAAAGTCG ATACGAGGC。

2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

如圖2所示，在25μL反應(yīng)體系中，當(dāng)反應(yīng)體系為MgSO4濃度為6mmol/L，甜菜堿 0.8mol/L、dNTPs 1.6mmol/L，反應(yīng)條件為63℃恒溫反應(yīng)60min，80℃滅活5min結(jié)束反應(yīng)時，實時濁度儀顯示擴增結(jié)果的出峰時間為30min左右，峰高為0.18，出峰時間和峰高

圖1 第3套引物的擴增結(jié)果Fig.1 The amplification results of No.3 primers

圖2 LAMP反應(yīng)體系和條件優(yōu)化后的Bt176擴增效果Fig.2 The amplification results of Maize Bt176 after the LAMP reaction system and the parameters were optimized

2.3 靈敏度實驗

用0%、0.1%、0.5%、1%、5%的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176標(biāo)準(zhǔn)品進行靈敏度實驗，顯色法結(jié)果見圖3，實時濁度儀結(jié)果見圖4。

實驗結(jié)果顯示，第3套的引物能從玉米樣品中檢出含量為0.5%的轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt176，即靈敏度達(dá)到0.5%。

圖3 靈敏度實驗的LAMP顯色法檢測結(jié)果Fig.3 Specificity test of Bt176 LAMP assay(colour)

2.4 特異性實驗

實驗結(jié)果顯示，LAMP方法的引物特異性良好，可準(zhǔn)確檢測出玉米Bt176的標(biāo)準(zhǔn)品、含有Bt176轉(zhuǎn)基因成分的冷凍玉米，其他樣品均沒有發(fā)生特異性擴增，檢測結(jié)果與歐盟采用的實時熒光PCR官方檢測方法的檢測結(jié)果一致，符合率達(dá)到100%。

圖4 靈敏度實驗的LAMP濁度法檢測結(jié)果Fig.4 Specificity test of Bt176 LAMP assay(turbidity)

2.5 穩(wěn)定性實驗

在上述全部實驗中，LAMP實時濁度法和顯色法均得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的結(jié)果，假陽性率和假陰性率均為0。

2.6 討論

2.6.1 方法的適用性 由于轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系已經(jīng)退市，理論上正規(guī)進口的玉米和玉米制品中應(yīng)當(dāng)不再含有轉(zhuǎn)基因玉米Bt176成分。在本文的方法驗證過程中也確實遇到難以獲得含有該品系的商品的情況。不過，不能排除過去非法流入我國的轉(zhuǎn)基因玉米種植、留種、生產(chǎn)加工的可能性，以及轉(zhuǎn)基因玉米Bt176主要種植國家殘存儲糧的后續(xù)銷售。實際上，未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系非法在我國大面積種植的報道時有發(fā)生［19－20］。為此，本文在為農(nóng)食產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢驗監(jiān)管提供技術(shù)支撐方面仍然具有重要的現(xiàn)實意義。

考慮到方法驗證過程中缺少相關(guān)的實際樣品，特別是缺少玉米加工制品，本文提出，所建立的方法適用于檢測玉米原糧中轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系成分的檢測，不建議用于玉米加工制品的檢測。

2.6.2 兩種LAMP結(jié)果判斷方式的技術(shù)優(yōu)劣LAMP的實時濁度法和顯色法兩種結(jié)果判讀方式都能準(zhǔn)確判斷實驗結(jié)果。實時濁度法采用儀器設(shè)備實時記錄反應(yīng)體系中的濁度變化，最主要的特點是可對實驗過程進行在線監(jiān)控，與顯色法肉眼判斷相比記錄數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確客觀。顯色法是終點判斷法，不需要依靠儀器，僅通過肉眼觀察顏色的變化判斷結(jié)果。因此，在方法建立和優(yōu)化階段，采用濁度法能夠迅速有效地選擇適宜的參數(shù)和條件，對簡化研究工作有很大的好處。特別是對于引物的篩選，如果兩套引物都能夠發(fā)生特異性擴增，采用顯色法進行結(jié)果判斷會得到兩個相似的實驗結(jié)果，而采用濁度法則可以通過濁度曲線上出峰時間、峰高和曲線的平滑程度判斷出兩套引物的擴增效率，為引物的篩選提供了更加可靠的數(shù)據(jù)。與此同時，在方法的實際應(yīng)用過程中，采用顯色法更為簡便，非常適合基層實驗室和現(xiàn)場檢測用途。

3 結(jié)論

本文建立的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系特異性LAMP檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測出轉(zhuǎn)基因玉米Bt176成分，靈敏度達(dá)到0.5%，特異性和穩(wěn)定性均達(dá)到100%。本方法實驗成本低廉、操作簡便、無需大型設(shè)備，在滿足我國大宗糧谷和飼料日常檢驗和快速通關(guān)需要的同時也是我國轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測手段的一種有益補充。

［1］中華人民共和國國務(wù)院令第304號《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》

［2］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部令第9號《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》

［3］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局令第62號《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》

［4］SN/T 1196－2003，玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法［S］.

［5］NYB869HGG－8Y2007，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種定性PCR方法［S］.

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