上海臨港海域產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選及鑒定

張 祁，寧喜斌

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵酶的總稱，其銷量至少占全球酶制劑市場的60%～65%［1］，已廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、制革、醫(yī)藥、飼料、環(huán)境保護(hù)、膠片中銀的回收等眾多領(lǐng)域［2－4］。目前工業(yè)用蛋白酶大多由芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株產(chǎn)生［5－6］，經(jīng)過條件優(yōu)化及誘變處理蛋白酶的產(chǎn)量及穩(wěn)定性較高，但無法滿足市場對特殊性能蛋白酶的需求，因此篩選新型蛋白酶產(chǎn)生菌株意義重大。海洋微生物是新型蛋白酶的重要來源，與陸地微生物相比海洋微生物具有獨(dú)特的生理特點(diǎn)、代謝途徑及營養(yǎng)利用方式，因此其產(chǎn)生的酶及其他代謝產(chǎn)物往往具有特殊性能［7］。目前從海洋環(huán)境中篩選得到的產(chǎn)蛋白酶菌株主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)［8］、弧菌屬(Vibrio)［9］、交替假單胞 菌 屬 (Pseudoalteromonas)［10－11］、 黃 桿 菌 屬(Flavobacterium)［12］、希瓦氏菌屬(Shewanella)［13］、海桿菌屬(Marinobacter)［14］等。本研究從上海臨港海域分離、篩選產(chǎn)蛋白酶的海洋細(xì)菌，并對其中1株蛋白酶活力較高的菌株進(jìn)行鑒定及生長特性、酶學(xué)特性的初步研究。為了解上海臨港海域海洋細(xì)菌及產(chǎn)蛋白酶菌株的多樣性奠定了基礎(chǔ)，同時為尋找新型特殊蛋白酶高產(chǎn)菌株開拓了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 2011年4～12月于上海市臨港海域采集海水及海泥樣品，用無菌采樣器采集水面下30～100cm的海水樣品及3～10cm深的海泥樣品，樣品采集后2h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室處理分析;福林酚試劑 上海荔達(dá)生物科技有限公司;酪氨酸 Sigma公司;柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒及PCR引物 生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA產(chǎn)物純化試劑盒 北京索來寶科技有限公司;瓊脂糖 加拿大Bio Basic INC公司;EB 上海華舜生物工程有限公司;1kb GeneRuler Fermentas公司;其余試劑 均采用國產(chǎn)分析純;2116E培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨5，磷酸鐵0.1，酵母粉1，瓊脂15，海水配制，pH7.5［15］;酪蛋白培養(yǎng)基(g/L)干酪素 5，酵母粉1，瓊脂15，海水配制，pH7.5;種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖5，海水配制，pH7.5［16］;海水 取自上海市臨港海域，過濾沉淀，高壓滅菌后，4℃保藏備用;酸性平板 用 HCl調(diào)至pH5并將瓊脂量增加為25g/L;堿性平板 用1%(W/V)Na2CO3調(diào)pH10，含鹽平板添加10%(W/V)的NaCl。

pH730臺式pH精密測試儀 德國WTW;UV2300分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;PTC－200 PCR儀 美國 Bio－Rad公司;GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio－Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海洋細(xì)菌的分離和純化 海水和海泥樣品經(jīng)梯度稀釋后，取0.1mL稀釋液分別涂布于2116E平板和酪蛋白平板上，并分別于以下5種條件培養(yǎng):A－平板 pH5，28℃培養(yǎng);B－平板 pH7.5，28℃培養(yǎng);C－平板pH10，28℃培養(yǎng);D－平板中添加10%(W/V)的 NaCl，pH7.5，28℃培養(yǎng);E－平板 pH7.5，55℃培養(yǎng)。根據(jù)菌株在2116E平板和酪蛋白平板上的菌落大小、形態(tài)、顏色等特征初步分離篩選。挑取單菌落于相應(yīng)pH的2116E平板反復(fù)劃線分離，將純化后的菌株編號并轉(zhuǎn)接于2116E斜面，4℃保存。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

1.2.2.1 產(chǎn)酶菌株的初篩 將保存的菌株用2116E培養(yǎng)基復(fù)壯幾次，用接種針點(diǎn)種于酪蛋白平板并于相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h。測量菌落直徑(d)和透明圈直徑(D)，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)，各測3次，計(jì)算平均值。對于透明圈不明顯的，可以在酪蛋白平板上滴加10%(W/V)的三氯乙酸溶液(TCA)，將酪蛋白沉淀，透明圈會更明顯。通過比較D/d值初步判斷菌株分泌胞外蛋白酶能力的大小。

1.2.2.2 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩 挑取試管斜面活化后的菌種1環(huán)接于種子培養(yǎng)基中，120r/min、28℃振蕩培養(yǎng)16h，得到種子液，再以2%(V/V)的接種量接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，120r/min、28℃振蕩培養(yǎng)48h，發(fā)酵液10000r/min、4℃離心10min，上清液即為粗酶液，測定上清液中蛋白酶活力。

1.2.3 酶活力測定方法 采用福林酚顯色法［17］進(jìn)行蛋白酶活力的測定。具體步驟如下:1mL稀釋酶液加入2%(W/V)的酪蛋白底物1mL，適當(dāng)溫度反應(yīng)10min，加入2mL 0.4mol/L的TCA終止反應(yīng)。空白對照是1mL酶液加入2mL 0.4mol/L的TCA使其失活，然后加入1mL酪蛋白底物。離心取上清1mL，加入5mL 0.4mol/L Na2CO3溶液和1mL福林酚試劑，混勻，40℃保溫20min，測定OD680值。酶活數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。一定條件下，每分鐘催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸所需的酶量定義為1個酶活力單位(U/mL)。

1.2.4 生理生化鑒定 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第九版)》［18］并參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［19］的部分方法對所篩選出的菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.5 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［20］設(shè)計(jì)引物。用柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4min，94℃ 變 性 1min，57℃ 退 火 30s，70℃ 延 伸1.5min，30 個循環(huán)，72℃延伸7min，4℃冷卻。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增條帶用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，Blastn搜索同源序列，選取相關(guān)序列，采用Clustal X 2.0進(jìn)行多序列比對，用MEGA 5.1軟件中的鄰接法(Neighbor－joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，并用自舉法檢測置信度，自舉數(shù)據(jù)集1000次。

1.2.6 菌株生長特性的研究

1.2.6.1 溫度對菌株生長的影響 用海水配制2116E液體培養(yǎng)基，取SE2011的種子液0.1mL，接種于 5mL 液體培養(yǎng)基中，分別在15、20、25、30、35、40℃條件下120r/min振蕩培養(yǎng)64h，每隔8h取樣，測定OD600。

1.2.6.2 鹽度對菌株生長的影響 用蒸餾水配制2116E液體培養(yǎng)基，分取SE2011的種子液0.1mL接種于含有0%、0.5%、1%、3%、5%、7%、9%(W/V)NaCl濃度的5mL液體培養(yǎng)基中，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)24h，每隔3h取樣，測定OD600。

1.2.7 酶學(xué)特性的研究

1.2.7.1 菌株SE2011所產(chǎn)蛋白酶最適溫度的測定 將粗酶液溶于pH8.0的Tris－HCl緩沖液中，分別設(shè)定 30、40、50、55、60、70、80、90℃，8 個溫度梯度，將稀釋酶液與酪蛋白底物在不同溫度下分別反應(yīng)10min。用福林酚法測定不同溫度下的酶活力，以確定其最適溫度。

1.2.7.2 菌株SE2011所產(chǎn)蛋白酶最適pH的測定配制0.05mol/L的pH5.0～11.0緩沖溶液，緩沖液體系如下:檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0～6.0)，磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，Tris－HCl緩沖液(pH8.0)，甘氨酸－NaOH緩沖液(pH9.0～11.0)。用不同pH的緩沖液配制2%(W/V)的酪蛋白底物并稀釋粗酶液，取1mL稀釋酶液于55℃測定不同pH下的酶活力，以確定其最適pH。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較(p＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋細(xì)菌分離結(jié)果

對20份海水樣品和10份海泥樣品中的海洋細(xì)菌進(jìn)行分離純化，共獲得170株海洋細(xì)菌，99株分離自2116E平板，71株分離自酪蛋白平板，表明2116E培養(yǎng)基更適合用于海洋細(xì)菌的分離。從樣品來源分析，從海泥樣品中分離得到的海洋細(xì)菌為103株，占分離菌株的60.6%，從海水樣品中分離得到的海洋細(xì)菌為67株，占分離菌株的39.4%。從海泥樣品中分離得到的菌株在2116E平板上顏色較為豐富，呈現(xiàn)白色、乳白色、黃色、橘黃色、米黃色、黃綠色、粉紅色等顏色，并且菌落形態(tài)也較為多樣，大多數(shù)菌落邊緣較為整齊，少數(shù)呈現(xiàn)不規(guī)則的菱形、橢圓形、絲狀等。從海水樣品中分離得到的海洋細(xì)菌在2116E平板上顏色比較單一，以乳白色和橘黃色為主，少數(shù)呈現(xiàn)粉紅色及黃綠色，菌落邊緣多較為整齊。從培養(yǎng)條件分析，中性平板分離得到111株，產(chǎn)蛋白酶菌株有101株;酸性平板分離得到24株，產(chǎn)蛋白酶菌株有14株;堿性平板分離得到11株，產(chǎn)蛋白酶菌株有1株;添加10%的NaCl平板分離得到8株，產(chǎn)蛋白酶菌株有3株;55℃條件下培養(yǎng)分離得到16株，產(chǎn)蛋白酶菌株有8株，分離結(jié)果見圖1。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選結(jié)果Table 1 The screening results of protease－producing stains

圖1 海洋細(xì)菌分離結(jié)果Fig.1 Marine bacteria isolation results

2.2 產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選結(jié)果

用點(diǎn)種法對全部170株菌株海洋細(xì)菌進(jìn)行了篩選，其中127株可產(chǎn)蛋白酶，有18株菌的D/d值大于8.0，用福林酚法進(jìn)行復(fù)篩，篩選結(jié)果見表1。從復(fù)篩結(jié)果可以看出，蛋白酶活力的高低與D/d值不完全呈正比關(guān)系，這與文獻(xiàn)［21－22］得出的結(jié)論一致。分析其原因可能是每批酪蛋白平板中酪蛋白顆粒的大小、平板的厚度及含鹽量的差異會影響透明圈大小;固體和液體培養(yǎng)條件的不同;同一發(fā)酵時間和酶作用溫度不可能是每一株菌的最適產(chǎn)酶時間和酶作用溫度，不同菌株具有不同的蛋白酶酶系等［23］。因此在點(diǎn)種法初篩后，進(jìn)行福林酚法復(fù)篩是非常必要的。通過測定酶活力，菌株SE2011的酶活力最高，在40℃、pH7.5條件下與底物反應(yīng)，酶活力可達(dá)到(747.12±0.38)U/mL，因此選擇該菌作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。菌株SE2011在酪蛋白平板點(diǎn)種見圖2。

圖2 菌株SE2011在酪蛋白平板培養(yǎng)48h形成的透明圈Fig.2 Proteolysis zone of strain SE2011 which culture at casein plates for 48h

2.3 形態(tài)及生理生化鑒定

菌株SE2011在2116E平板上生長時菌落呈淡黃色，半透明，表面光滑，濕潤，兩面顏色一致，邊緣整齊;染色觀察為革蘭氏陰性桿菌(多數(shù)稍彎曲)，無芽孢;生理生化測定結(jié)果見表2，菌株SE2011可水解淀粉、液化明膠，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖，但不能利用鼠李糖、蜜二糖、苦杏仁苷和肌醇。氧化酶、過氧化氫酶、V.P反應(yīng)、M.R反應(yīng)、精氨酸雙水解酶為陽性。鳥氨酸脫羧酶為陰性，不產(chǎn)生H2S。通過查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，將菌株SE2011初步鑒定為鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)。

表2 菌株SE2011的生理生化特性Table 2 Biochemical characteristics of strain SE2011

2.4 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹

以SE2011的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶見圖3，經(jīng)測序獲得16S rDNA序列為1444bp，將序列數(shù)據(jù)與GenBank中已存在細(xì)菌的16S rDNA基因序列比對分析。比對結(jié)果表明，菌株SE2011與弧菌屬細(xì)菌具有較高同源性，與Listonella anguillarum同源性高達(dá)99%。選取相關(guān)序列構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖4所示，該菌與菌株Listonella anguillarum有較大的同源性且處在同一分支。綜合形態(tài)、生理生化鑒定及16S rDNA序列比對結(jié)果，將菌株SE2011鑒定為鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)。

圖3 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoresis result of PCR products of 16S rDNA

圖4 菌株SE2011的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the SE2011 bacterium

2.5 溫度對菌株生長的影響

海洋微生物生長的典型特征是低溫性和耐鹽性［23］，因此有必要研究所篩選菌株的生長溫度和耐鹽性。由圖5可知，菌株SE2011在15～30℃生長較快，在35℃和40℃生長緩慢，表明該菌為中度嗜冷菌。該菌在30℃培養(yǎng)16h達(dá)到穩(wěn)定期，菌體的OD600約為1.9000。多重比較顯示25、30℃不同培養(yǎng)時間OD值差異不顯著(p＞0.05)。

2.6 鹽度對菌株生長的影響

不同鹽度對菌株的影響不同，如圖6所示，菌株SE2011在無NaCl或添加9%的NaCl條件下幾乎不生長，在整個培養(yǎng)周期OD值差異不顯著(p＞0.05)。在鹽度為0.5%～5%時生長良好，最適生長鹽度為1%，說明該菌為海洋細(xì)菌或已適應(yīng)海洋高鹽環(huán)境的陸源細(xì)菌。在1%～3%鹽度下培養(yǎng)9h達(dá)到穩(wěn)定期，菌體OD600約為2.000。多重比較顯示1%鹽度和3%鹽度不同培養(yǎng)時間OD值差異不顯著(p＞0.05)。

圖5 溫度對SE2011生長的影響Fig.5 Effect of the temperature on growth of SE2011

圖6 鹽度對SE2011生長的影響Fig.6 Effect of the salinity on growth of SE2011

2.7 菌株SE2011所產(chǎn)蛋白酶最適溫度的測定

測定菌株SE2011所產(chǎn)蛋白酶與底物在不同反應(yīng)溫度下的酶活力，結(jié)果顯示該酶在30～90℃時有活力，在55℃時達(dá)到最高，與其他反應(yīng)溫度下的酶活力差異極顯著(p＜0.01)，表明該蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，屬中溫蛋白酶，如圖7所示。在30℃和90℃還可保留最大酶活力的34.6%和14.2%。

圖7 溫度對酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on protease activity of SE2011 crude protease

2.8 菌株SE2011所產(chǎn)蛋白酶最適pH的測定

菌株SE2011所產(chǎn)蛋白酶在pH5.0～11.0條件下酶活力變化見圖8。該酶在pH8.0時酶活力達(dá)到最大，與其他pH條件下反應(yīng)的酶活力差異極顯著(p＜0.01)，表明該酶屬堿性蛋白酶范疇。在 pH6.0和pH10.0時還可保留最大酶活力的28.2%和25.9%。

3 結(jié)論與討論

圖8 pH對酶活力的影響Fig.8 Effect of pH on protease activity of the crude protease from SE2011

從上海臨港海域采集的海水及海泥樣品經(jīng)梯度稀釋后分別于中性、酸性、堿性、添加10%的NaCl和55℃，5種條件下培養(yǎng)，共分離得到170株海洋細(xì)菌，其中中性平板分離得到的海洋細(xì)菌及產(chǎn)酶菌株最多，這與上海臨港地區(qū)的自然環(huán)境相一致(海水溫度在9～29℃，pH在8.0左右)，但在此環(huán)境中也分離到了一些能耐受極限條件的海洋細(xì)菌及產(chǎn)酶菌株。經(jīng)酪蛋白點(diǎn)種法初篩發(fā)現(xiàn)有127株可產(chǎn)蛋白酶，由此可以看出，上海臨港海域存在種類較為豐富的具有產(chǎn)胞外蛋白酶能力的海洋細(xì)菌，為研究上海臨港海域海洋細(xì)菌及所產(chǎn)胞外蛋白酶的多樣性提供了有利條件。

選擇D/d值大于8.0的菌株進(jìn)行福林酚顯色法復(fù)篩，篩選得到一株產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌株SE2011。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及16S rDNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)。

生長特性研究表明，該菌在15～30℃范圍內(nèi)生長良好，最適生長溫度為30℃;生長鹽度范圍為0～7%(W/V)，在無NaCl時生長不良，最適生長鹽度為1%(W/V)，說明其為海洋細(xì)菌。酶學(xué)性質(zhì)研究表明該菌所產(chǎn)蛋白酶有較寬的作用溫度30～90℃，最適溫度為55℃;在pH6～10范圍內(nèi)呈現(xiàn)活力，最適pH為8.0。

本研究表明菌株SE2011是一株性狀優(yōu)良的出發(fā)菌株，后續(xù)研究的重點(diǎn)主要分為兩個方向，一是用基因工程改良該菌，將產(chǎn)酶基因克隆構(gòu)建重組工程菌，從而解決其在淡水中生長不良、酶產(chǎn)量不高而帶來的生產(chǎn)成本問題;二是對酶的純化，以及酶學(xué)性質(zhì)的深入研究。

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