免疫磁珠富集技術(shù)聯(lián)合選擇性培養(yǎng)基快速檢測單增李斯特菌

聞一鳴，李志清，童吉宇，向軍儉

廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室 暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣東 廣州 510632

免疫磁珠富集技術(shù)聯(lián)合選擇性培養(yǎng)基快速檢測單增李斯特菌

聞一鳴，李志清，童吉宇，向軍儉

廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室 暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣東 廣州 510632

聞一鳴, 李志清, 童吉宇, 等. 免疫磁珠富集技術(shù)聯(lián)合選擇性培養(yǎng)基快速檢測單增李斯特菌. 生物工程學(xué)報, 2013,29(5): 672?680.

Wen YM, Li ZQ, Tong JY, et al. Rapid detection ofListeria monocytogenesby immunomagnetic separation combined with selective medium. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 672?680.

單增李斯特菌是一種危害極大的食源性致病菌，建立快速及特異的檢測方法對于食品安全監(jiān)控尤為重要。文中聯(lián)合免疫磁珠與選擇性培養(yǎng)基對不同濃度 (101～105CFU/mL) 單增李斯特菌進行檢測，并對3種李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌進行交叉試驗；同時模擬食物污染，探索免疫磁珠-平板法檢測樣品的檢測限以及該方法的最快檢測時間。結(jié)果顯示特異性免疫磁珠聯(lián)合選擇性平板法可檢出濃度為103CFU/mL及以上的單增李斯特菌；牛奶樣品僅需6 h增菌能被檢出，檢測限為0.7 CFU/mL。聯(lián)合使用免疫磁珠富集技術(shù)與選擇性培養(yǎng)基，能在30 h內(nèi)完成對牛奶樣品的檢測，較國標(biāo)法減少38 h以上，且具有同等的靈敏度。

單增李斯特菌，免疫磁珠，選擇性培養(yǎng)基，檢測限

李斯特菌是一類普遍存在于環(huán)境中的細菌，而單增李斯特菌則是李斯特菌中唯一的一種人畜共患病致病菌[1]，也是常見的食源性致病菌之一[2]，它能引起腸胃炎癥、腦膜炎、敗血病、流產(chǎn)等臨床癥狀，對新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下人群的危害尤為嚴(yán)重，致死率高達20%[3-4]。單核增生李斯特氏菌廣泛存在于各種食物中，并能在食品加工后的冷凍及真空包裝等條件下存活，是食品安全的一大隱患[5-6]。

目前，檢測單核增生李斯特氏菌的傳統(tǒng)方法是通過對樣品進行二次增菌，利用選擇性分離培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基進行分離與鑒定。選擇性分離培養(yǎng)基如 PALCAM、OXA，或顯色培養(yǎng)基如CHROMagar李斯特培養(yǎng)基，它們主要通過成分中的某種物質(zhì)與細菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化，從而區(qū)分不同的菌株[7-8]。選擇性培養(yǎng)基常用于區(qū)分不同種屬的細菌，但難以鑒別屬內(nèi)的不同菌株；顯色培養(yǎng)基具有高特異性的特點，但由于其價格昂貴、檢測周期長等缺點，實際應(yīng)用范圍不廣。

在檢測成分較復(fù)雜的樣品時 (如食品、水樣和土壤)，樣品的預(yù)處理過程是必不可少的環(huán)節(jié)。免疫磁珠分離技術(shù) (Immunomagnetic separation，IMS) 是一種具有高特異性、快速、操作簡便等優(yōu)勢的富集方法[9-10]，其原理是磁珠表面的活性基團先與特異性抗體進行偶聯(lián)，形成免疫磁珠，然后在液相中與目的待測物特異性結(jié)合，最后通過磁場作用將待測物分離并收集。該技術(shù)根據(jù)抗原抗體之間的特異性反應(yīng)，高效濃縮目的樣品，并保留樣品原有生物活性，利于下游的檢測或應(yīng)用，因此廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥和環(huán)境工程等學(xué)科，尤其適用于微生物檢測的樣品前處理[11-12]。

本文先利用免疫磁珠對樣品進行特異性篩選及富集，再聯(lián)合選擇性培養(yǎng)基進行微生物學(xué)鑒定，最后通過一步增菌法成功檢測出液態(tài)中的單增李斯特菌；此外，通過模擬受污染食物樣品初步確定了該方法在食品檢測中的檢測限。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

PALCAM 李斯特基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯 (TSB-YE)，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，純牛奶購于超市。Dynabeads M-280甲苯磺酸基活化磁珠 (美國Invitrogen公司)，混勻儀Dynal-MIX1(美國 Invitrogen公司)，磁分離器 (西安北美基因公司)，Multiskan酶標(biāo)儀 (Thermo公司)，臺式恒溫搖蕩器 (培英公司)，人工氣候箱 (廣東省醫(yī)療器械廠)，H-3000N掃描電子顯微鏡 (日本日立公司)。

1.2 菌株

單增李斯特菌L. monocytogenesCMCC 54002 (血清型 1/2c)、CMCC 54003 (1/2a) 和ATCC 19115 (4b)，英諾克李斯特菌 (L. innocuaLI456)，威爾斯李斯特菌L.welshimeri，格氏李斯特菌Listeria grayi，副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticusATCC 17802，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 6538，銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaATCC 15442，大腸桿菌Escherichia coliO157: H7 8099和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisATCC 9372。以上所用菌株均由廣東省微生物研究所饋贈。

1.3 免疫磁珠的制備

1.3.1 抗體的純化

運用硫酸銨沉淀及 ProteinG親和層析法純化腹水型 1B10A7抗體 (該抗體為實驗室前期制備的單增李斯特菌特異性單克隆抗體)，SDS-PAGE鑒定純化后的單克隆抗體，?20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 間接ELISA測定抗體效價及抗體特異性分析

以甲醛滅活的濃度為109CFU/mL的LM作為包被抗原，4 ℃孵育16 h；含5%脫脂奶粉的0.015 mol/L PBST封閉酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h；加入梯度稀釋的1B10A7抗體，37 ℃孵育1 h；加入 HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG抗體，37 ℃孵育30 min；加入TMB底物顯色，避光反應(yīng)10 min；2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測OD450值；以濃度為108CFU/mL的3種LM (1/2c、1/2a及4b血清型)、英諾克李斯特菌、威爾斯李斯特菌、格氏李斯特菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌O157和枯草芽胞桿菌作為包被抗原，4 ℃孵育 16 h；含 5%脫脂奶粉的 0.015 mol/L PBST封閉酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h；1B10A7抗體稀釋4 000倍作為一抗加入，37 ℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育30 min；加入TMB底物顯色，避光反應(yīng)10 min；2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測OD450值。

1.3.3 磁珠偶聯(lián)抗體

根據(jù)DYNABEADS M-280 TOSYLACTIVATED試劑盒說明書，甲苯磺?；罨胖槿苡贐uffer A (0.1 mol/L硼酸緩沖液，pH 9.5)，加入20 μg的1B10A7單抗和Buffer C (3 mol/L硫酸銨，pH 9.5)，37 ℃渦旋孵育18 h；磁分離器分離上清與磁珠，用含有0.5% BSA的0.01 mol/L PBS封閉磁珠，37 ℃孵育1 h；最后重溶于含有0.1%BSA的0.01 mol/L PBS。同理制備無關(guān)抗體與磁珠結(jié)合，作為陰性對照組。

1.4 IMB-選擇性平板法檢測單增李斯特菌

1.4.1 LM的培養(yǎng)

分別將3種LM (CMCC 54002、CMCC 54003和ATCC 19115) 接種于TSB-YE液態(tài)培養(yǎng)基，置搖床中30 ℃培養(yǎng)18 h。

1.4.2 菌液的稀釋

以滅菌的0.01 mol/L PBS對菌液進行梯度稀釋。細菌原液濃度約為109CFU/mL，取500 μL原液加入至4.5 mL PBS中，混合后再取500 μL加至4.5 mL PBS中，以相同的方法把菌液稀釋到104CFU/mL和103CFU/mL。取50 μL各濃度菌液，涂布于 TSB-YE固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，以確定菌濃度。

1.4.3 免疫磁珠捕菌

每種細菌每個濃度各取1 mL與25 μL免疫磁珠 (包括實驗組和陰性對照組) 混合，置于Dynal-MIX1混勻儀中37 ℃反應(yīng)1 h；0.01 mol/L PBST洗滌2次，磁分離器分離上清；免疫磁珠重溶于50 μL PBS，涂于無菌的PALCAM固體培養(yǎng)基中；37 ℃孵育24 h，計算細菌的數(shù)量。

1.4.4 掃描電鏡下觀察免疫磁珠與單增李斯特菌的結(jié)合

取1 mL濃度為104CFU/mL的LM (CMCC 54002) 與25 μL免疫磁珠在37 ℃下反應(yīng)1 h，2.5%戊二醛洗 1次，磁分離除去上清；2.5%戊二醛處理樣品，室溫下靜置2 h，磁分離棄上清，PBST洗3次；磁分離棄上清，PBST洗3次；30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇脫水各2次；乙酸異戊酯置換2次；臨界點干燥器處理對樣品進行CO2臨界點干燥；干燥后的樣品經(jīng)噴金后置于掃描電鏡下觀察。

1.4.5 IMB-PALCAM靈敏性分析

接種LM于TSB-YE液體培養(yǎng)基，置搖床中30 ℃培養(yǎng)18 h。參照1.3.2的方法，把菌液濃度稀釋至濃度為 105、104、103、102、101CFU/mL。取50 μL各濃度菌液，涂布于TSB-YE固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，以確定菌的濃度。免疫磁珠捕菌步驟參照1.3.3。

1.4.6 IMB-PALCAM交叉性分析

英諾克李斯特菌、格氏李斯特菌和威爾斯李斯特菌分別接種于TSB-YE液體培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯，副溶血弧菌接種于含3%氯化鈉的LB培養(yǎng)基中，接種后置于搖床中30 ℃培養(yǎng)18 h。參照1.3.2，把各種菌株的菌濃度調(diào)至104CFU/mL，每種菌各取1 mL與25 μL已偶聯(lián)1B10A7單抗的磁珠反應(yīng)，同時取1 mL同樣濃度的菌液與25 μL偶聯(lián)無關(guān)抗體的磁珠反應(yīng)，37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBST洗2次，重溶至50 μL PBS，涂布于PALCAM平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。次日計算平板上菌落數(shù)。

1.5 IMB-PALCAM檢測人工污染食品樣品

1.5.1 IMB-PALCAM 檢測不同濃度人工污染牛奶樣品

接種LM于5 mL TSB-YE液體培養(yǎng)基，于搖床中培養(yǎng)18 h；次日以無菌PBS倍比稀釋菌液，菌濃度調(diào)至102CFU/mL水平，再進行倍比稀釋 (2×、4×、8×和 16×)，每濃度各取 1 mL 菌液與9 mL純牛奶混合，作為人造食物污染樣品。每個濃度下的樣品各取1 mL，加入到9 mL無菌的TSB-YE液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h；次日，每個濃度各取1 mL菌液與20 μL免疫磁珠于37 ℃下反應(yīng)1 h，PBST洗2次，磁分離后溶解于50 μL PBS，涂于PALCAM培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，計數(shù)。

1.5.2 IMB-PALCAM 檢測不同增菌時間下的人造污染牛奶樣品

接種LM于5 mL TSB-YE液體培養(yǎng)基，于搖床中培養(yǎng)18 h；次日以無菌PBS倍比稀釋菌液，菌濃度調(diào)至低于 10 CFU/mL水平，設(shè)置 6個不同增菌時間的實驗組，分別加入1 mL該濃度下菌液和9 mL純牛奶，增菌2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h。增菌后每組各取1 mL牛奶樣品與20 μL免疫磁珠反應(yīng)，步驟參照1.5.1。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

本實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel與SPSS處理。

2 結(jié)果

2.1 腹水型鼠源單克隆抗體的純化效果及效價測定

將純化后的 1B10A7鼠源單抗進行 SDSPAGE，后經(jīng)考馬斯亮藍染色，在55 kDa和25 kDa附近有明顯條帶，且雜帶較少，抗體純度較高。經(jīng)間接 ELISA測定，甲醛滅活 LM與 1B10A7鼠源單抗特異性結(jié)合，抗體效價約為1.6×104。

2.2 腹水型鼠源單克隆抗體的特異性分析

如圖1所示，1B10A7鼠源單抗與3種血清型的LM菌存在較好的反應(yīng)性，與非單增李斯特菌株反應(yīng)性較弱，但該抗體與英諾克李斯特菌和金黃色葡萄球菌存在一定的交叉反應(yīng)。

2.3 免疫磁珠-選擇性平板法 (IMB-PALCAM)檢測3種單增李斯特菌的結(jié)果

如表1所示，IMB-PALCAM檢測3種不同血清型的LM均呈陽性結(jié)果。

圖1 1B10A7單抗特異性分析Fig. 1 Specificity analysis of 1B10A7 monoclonal antibody. LM 1/2c: Listeria monocytogenes CMCC54002; LM 1/2a: Listeria monocytogenes CMCC54003; LM 4b: Listeria monocytogenes ATCC19115; LW: Listeria welshimeri; LI:Listeria innocua; LG: Listeria grayi; SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EO: Escherichia coli O157: H7; BS: Bacillus subtilis.

表1 IMB-PALCAM檢測不同血清型LMTable1 Detection of Listeria monocytogenes of different serotypes by IMB-PALCAM

2.4 掃描電鏡下觀察免疫磁珠與單增李斯特菌的結(jié)合

免疫磁珠與LM菌體在PBS中結(jié)合，經(jīng)過戊二醛固定及乙醇梯度脫水后，在掃描電子顯微鏡(SEM) 下觀察兩者的結(jié)合，結(jié)果如圖2所示，粒徑為2.8 μm的磁珠與抗體偶聯(lián)后，能在液態(tài)中與LM 表面的抗原表位結(jié)合，形成復(fù)合物，說明制備的免疫磁珠能成功捕獲LM。

2.5 IMB-PALCAM法靈敏性分析結(jié)果

IMB-PALCAM法檢測101～105CFU/mL濃度下的LM，結(jié)果如表2所示，該法能檢測濃度為103CFU/mL以上的LM；對于濃度在102CFU/mL及以下水平的 LM，則無法檢出。因此IMB-PALCAM 法檢測 LM 的檢測限確定為103CFU/mL。

圖2 掃描電鏡下觀察免疫磁珠與單增李斯特菌的結(jié)合Fig. 2 Combination of immunomagnetic beads and Listeria monocytogenes in SEM. (A) LM were captured by immunomagnetic beads. (B) Control (Immunomagnetic beads only).

表2 IMB-PALCAM靈敏度分析Table 2 Sensitivity analysis of IMB-PALCAM

2.6 IMB-PALCAM法交叉性分析結(jié)果

經(jīng)培養(yǎng)16 h以上包括單增李斯特菌、英諾克李斯特菌、格氏李斯特菌、威爾斯李斯特菌在內(nèi)的李斯特菌屬能在PALCAM固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上形成灰黑色菌落，金黃色葡萄球菌形成淺黃色菌落，而副溶血弧菌卻不形成肉眼可見的菌落(圖3)。經(jīng)過IMB-PALCAM方法檢測104CFU/mL下的各種細菌，發(fā)現(xiàn)英諾克李斯特菌與金黃色葡萄球菌存在一定的交叉作用，其中英諾克李斯特菌形成與 LM 相似的灰黑色菌落，金黃色葡萄球菌則形成淺黃色菌落，從肉眼上能與LM區(qū)分開。

圖3 IMB-PALCAM法檢測不同種細菌的交叉反應(yīng)分析Fig. 3 Cross reaction analysis of IMB-PALCAM on different bacteria. LM: Listeria monocytogenes; LI:Listeria innocua; LG: Listeria grayi; LW: Listeria welshimeri; SA: staphylococcus aureus; VP: Vibrio parahaemolyticus; CFU: colony forming unit.

2.7 IMB-PALCAM 檢測人造食品污染樣品結(jié)果

2.7.1 IMB-顯色培養(yǎng)基法檢測不同濃度人造污染牛奶樣品

如表3所示，通過模擬制造受LM污染的食物樣品，經(jīng)24 h增菌，IMB-PALCAM法能檢測到LM濃度為102CFU/mL以下的受污染牛奶樣品，檢測限為6 CFU/mL。

2.7.2 IMB-顯色培養(yǎng)基法檢測不同增菌時間下的人造污染牛奶樣品

隨著受污染牛奶樣品增菌時間的延長，免疫磁珠的捕菌數(shù)量增加，且呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)增菌時間在6 h、8 h、10 h和12 h時，IMS-顯色培養(yǎng)基法能捕獲增菌后牛奶中的LM (表4)。

表3 IMB-PALCAM法檢測牛奶樣品中的LMTable 3 Detection of Listeria monocytogenes using IMB-PALCAM in milk samples

表4 IMB-PALCAM法檢測增菌時間不同的牛奶樣品Table 4 Detection of milk samples in different culture time using IMB-PALCAM

3 討論

本實驗室在前期已制備單增李斯特菌特異性抗體的過程中，已成功篩選出幾株各具特點的單抗，它們主要能夠識別經(jīng)甲醛滅活后LM的抗原表位，其中只有1B10A7細胞株所分泌的抗體能識別活菌表面抗原表位，并具有較高的親和力[13]，從而適用于制備單增李斯特菌特異性免疫磁珠且應(yīng)用于平板檢測法。

本研究應(yīng)用IMS-PALCAM法檢測LM，當(dāng)菌濃度高于103CFU/mL時，免疫磁珠的捕菌率在2%以上，能從1 mL菌液中富集到102CFU以上的 LM；當(dāng)菌濃度低于 103CFU/mL時，IMS-PALCAM法難以直接鑒別菌液中的LM，國外有報道指出，免疫磁珠富集技術(shù)與平板培養(yǎng)法聯(lián)用的檢測限在102～103CFU/mL之間[14-15]，由于在受污染食品中含菌量相對較低，或細菌活性不佳，IMS-PALCAM 法檢測食物樣品時，仍需要對樣品進行預(yù)增菌[16]。

單核增生性李斯特菌是一種常見的食源性致病微生物，能導(dǎo)致嚴(yán)重的食源性疾病且具有致死性，在牛奶、芝士、海鮮等多種食物中均有檢出[17-18]，因此針對該菌的食品檢測與監(jiān)控尤為重要[19]。傳統(tǒng)國標(biāo)法主要通過二次增菌法對LM分離培養(yǎng)，結(jié)合選擇性平板及生化鑒定進行檢測，結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時較長，需要3～7 d；近年發(fā)展起來的顯色培養(yǎng)基鑒別法與API Listeria法則加快了檢測速度，但仍然需要二次增菌，且檢測成本較高。本文研究的免疫磁珠-選擇性平板法具有快速檢測、步驟簡單、結(jié)果可靠的特點，對于含菌量在102CFU/mL以下的牛奶樣品，經(jīng)6 h增菌后就能鑒定樣品是否染菌。

然而，由于LM與英諾克李斯特菌存在較高的同源性[20-21]，1B10A7單抗不僅能特異性結(jié)合LM，還與英諾克李斯特菌存在交叉反應(yīng)，推測該單抗識別的是這兩種李斯特菌表面的共有表位。若需進一步區(qū)分兩種菌，可利用李斯特顯色培養(yǎng)基或 API Listeria等方法進行后續(xù)驗證。Wadud等[22]應(yīng)用免疫磁珠與顯色培養(yǎng)基(IMS-ALOA) 檢測LM，但由于該方法所需的顯色培養(yǎng)基成本較高，應(yīng)用范圍不廣。Yang等[23]結(jié)合IMS和實時熒光PCR的方法建立了一套快速的檢測方法，但該方法對儀器和實驗條件的要求甚高，不利于普及應(yīng)用。相比之下，本研究中所建立的檢測方法更適和用于進行食物樣品的初步篩選，為相關(guān)的食品安全檢測與監(jiān)控奠定了基礎(chǔ)。

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October 19, 2012; Accepted: December 18, 2012

Junjian Xiang. Tel: +86-20-85223259; E-mail: txjj@jnu.edu.cn

廣東省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目 (No. 2010B090301037) 資助。

Rapid detection ofListeria monocytogenesby immunomagnetic separation combined with selective medium

Yiming Wen, Zhiqing Li, Jiyu Tong, and Junjian Xiang

Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering,Antibody Engineering Center of Jinan University,Guangzhou510632,Guangdong,China

Listeria monocytogenesis a pathogenic bacterium, therefore, it is essential for food safety monitoring to establish a rapid and specific detecting method. In this study, immunomagnetic beads and selective medium were combined to detectListeria monocytogenesat different concentrations (101?105CFU/mL). Other three types ofListeriaspp.,Staphylococcus aureusandVibrio parahaemolyticuswere also detected to conduct the cross-reaction analysis. Meanwhile,contaminated milk samples were prepared to explore the limit of detection of immunomagnetic beads combining with selective medium. Results showed thatListeria monocytogenes with the concentration of 103CFU/mL and above was successfully detected. Milk samples were detected within 6 hours, with a detection limit of 0.7 CFU/mL. The method developed is capable of detecting milk samples within 30 h, which is 38 h faster compared with national standard method with the same sensitivity.

Listeria monocytogenes, immunomagnetic beads, selective plating, limit of detectiond

Supported by: Produce-Learn-Research Projects of Education Department in Guangdong Province (No. 2010B09301037).

(本文責(zé)編 陳宏宇)