熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響

杜瑞平 溫雅俐* 姚焰礎(chǔ) 江 山 高 民＊＊

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所，呼和浩特 010031;2.重慶市畜牧科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所，重慶 402460)

荷斯坦奶牛具有耐寒不耐熱的特性，炎熱的夏季，特別是高濕高熱的南方地區(qū)，奶牛容易發(fā)生熱應(yīng)激［1］，造成養(yǎng)殖效益嚴(yán)重下滑。熱應(yīng)激時，奶牛表現(xiàn)為呼吸加快、體溫升高、散熱量減少，從而導(dǎo)致食欲下降，采食量和產(chǎn)奶量顯著降低［2］;另外，生理代謝紊亂，內(nèi)分泌發(fā)生改變，直接導(dǎo)致奶牛的免疫力和繁殖性能顯著降低［3］。因此，確定熱應(yīng)激對奶牛代謝和生產(chǎn)性能影響的程度及作用機(jī)理，研發(fā)配套的熱應(yīng)激緩解技術(shù)并最終提高奶牛福利和牛場養(yǎng)殖效益已成為動物營養(yǎng)工作者的重要任務(wù)之一。國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于奶牛熱應(yīng)激已做了大量的研究，主要集中在熱應(yīng)激對奶牛生理機(jī)能［4－7］、采食消化［8－10］、血液生理生化指標(biāo)［11－12］、瘤胃內(nèi) 環(huán) 境［13－15］、生 產(chǎn) 性 能［2，16－17］以 及 繁 殖 性能［18－20］等影響的研究上，而關(guān)于熱應(yīng)激時奶牛瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)變化的研究較少。因此，本試驗采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響，旨在為改善和緩解熱應(yīng)激的不良影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

采用2×3交叉試驗設(shè)計，選擇18頭經(jīng)產(chǎn)中國荷斯坦奶牛，根據(jù)試驗前1周胎次、平均泌乳天數(shù)和產(chǎn)奶量相近的原則，分為泌乳前期(產(chǎn)后15～100d)組、泌乳中期(產(chǎn)后112～175d)組、泌乳后期(產(chǎn)后200～230d)組(表1)，每組6個重復(fù)，根據(jù)實測的牛場溫濕指數(shù)(temperature and humidity index，THI)變化，采用熱應(yīng)激與非熱應(yīng)激的自身對照試驗。預(yù)試期為15d，正試期分為熱應(yīng)激期(2010年7月20日—2010年8月30日)和非熱應(yīng)激期(2010年8月31日—2010年9月28日)。熱應(yīng)激期按照 Armstrong［21］的評價(即 THI＜ 72無熱應(yīng)激反應(yīng);72～79輕度熱應(yīng)激;80～89中度熱應(yīng)激;90及以上嚴(yán)重危險)又相應(yīng)分為熱應(yīng)激前期(2010年7月20日—2010年8月9日)、熱應(yīng)激中期(2010年8月10日—2010年8月13日)和熱應(yīng)激后期(2010年8月14日—2010年8月30日)。

表1 試驗分組Table 1 Experimental groups

1.2 飼養(yǎng)管理與試驗飼糧

按牛場正常飼養(yǎng)管理規(guī)程進(jìn)行。試驗?zāi)膛ｏ曫B(yǎng)于含有雙側(cè)排風(fēng)扇的拴系式雙列對頭牛舍(鐘樓式)中，每頭奶牛定欄定位飼喂，每天飼喂3次，即05:00～06:00、12:30～13:30、17:00～18:00。飼喂方式為先粗后精。精料定量飼喂，粗料自由采食，自由飲水。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.3 牛場THI的測定

在牛舍的中部和兩端距地面1.5 m高處分別掛置干濕球溫度計(河北武強(qiáng)滏陽儀表廠生產(chǎn)，有效量程:0～40℃，相對濕度:10% ～100%)，保證溫濕度表的有效通風(fēng)，防止陽光照射和雨淋，并避免奶牛觸及。每天08:00、14:00、20:00記錄干球溫度和濕球溫度，求3次平均值。計算公式為:

式中:Td為干球溫度(℃)，Tw為濕球溫度(℃)。

1.4 奶牛直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率的測定

分別于熱應(yīng)激前、中和后期及非熱應(yīng)激期選擇2d，在每天08:00、14:00、20:00分3次測定供試奶牛的直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率，取均值用于輔助熱應(yīng)激狀態(tài)的判定。具體方法參照《家畜環(huán)境衛(wèi)生學(xué)》［22］。

1.5 瘤胃液的采集與處理

分別于熱應(yīng)激的前、中和后期以及非熱應(yīng)激期選擇1d，在中午限制飼喂之后(14:00～15:00)，于18頭奶牛中隨機(jī)選擇6頭采集瘤胃液［22］，方法:奶牛綁定，口腔插管，用泵抽取瘤胃液。每頭奶牛采集200 mL，分別裝到10 mL滅菌離心管中，于－80℃保存以備微生物數(shù)量的測定。

1.6 微生物數(shù)量的測定

1.6.1 主要試劑

總 RNA提取試劑(Trizol，Invitrogen，美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Serve，上海);普通PCR擴(kuò)增試劑盒(Hot-start PCR Mix，Bio-Serve，上海);實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green I PCR Mix，Bio-Serve，上海)。

1.6.2 主要儀器

普通 PTC－200 PCR儀(MJ，美國);電泳儀(Bio-Rod，美國);組織勻漿儀(Pro Scientific，美國);NanoDrop1000微量分光光度計(Thermo，美國);凝膠成像分析儀(UVP，美國);5417R離心機(jī)(Eppendorf，德國);ABI7500實時熒光定量 PCR儀(ABI，美國)。

1.6.3 瘤胃液的預(yù)處理以及DNA的提取

1)瘤胃液樣本完全融化后，先用200目小塊紗布覆蓋于管口，然后倒置并用新的2 mL滅菌離心管收集約600 μL濾液，殘留物保存于－80℃;

2)將上步的600 μL濾液12 000 r/min離心10 min，留下沉淀繼續(xù)裂解，上清液約500 μL裝于新的2 mL滅菌離心管中－80℃保存?zhèn)溆?

3)在上步沉淀中加入500 μL一步法裂解液，振蕩混勻1 min，100 ℃煮10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清液約500 μL裝于新的2 mL滅菌離心管中;

4)將上步上清液12 000 r/min離心10 min，取上清液約400 μL裝于新的1.5 mL滅菌離心管中作為PCR擴(kuò)增模板。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimentaldiets(DM basis) %

1.6.4 引物設(shè)計

引物的設(shè)計與合成參考高愛武［23］的方法，并在此基礎(chǔ)上做了改進(jìn)。委托專業(yè)技術(shù)公司合成。具體引物設(shè)計見表3。凍干粉狀態(tài)的引物離心后，用滅菌超純水配制成 100 μmol/L貯備液和20 μmol/L工作液，－20 ℃保存。

1.6.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系見表4。

優(yōu)化反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 ～40 個循環(huán);72℃最終延伸15 min。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用SAS 9.0軟件包中的平衡試驗設(shè)計方差分析過程(ANOVA)，均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，其中 P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

表3 引物設(shè)計Table 3 Primerdesign

表4 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 4 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system

2 結(jié)果

2.1 牛舍環(huán)境溫度與THI的變化及試驗期奶牛直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率

5～25℃的環(huán)境溫度是奶牛的適溫區(qū)，當(dāng)牛舍溫度高于25℃或者THI＞72，即引起奶牛的熱應(yīng)激［24］。由表5可看出，在熱應(yīng)激前、中和后期牛舍平均氣溫在29.43～36.83℃，超出了奶牛的適溫區(qū)。由于試驗所在地濕度較高，所以選用THI作為評價指標(biāo)較為適宜。熱應(yīng)激前、中和后期牛舍平均THI在80.92～88.53之間，而非熱應(yīng)激期牛舍的THI＜72。判斷奶牛熱應(yīng)激的首要標(biāo)準(zhǔn)是THI，其次可結(jié)合生理指標(biāo)進(jìn)行判斷。奶牛正常直腸溫度為37.50～39.50℃，而奶牛正常呼吸頻率為10～30次/min，生理指標(biāo)一方面可與正常水平進(jìn)行比較，另一方面看這些指標(biāo)在熱應(yīng)激期和非熱應(yīng)激期是否差異顯著。所以THI再結(jié)合表6中生理指標(biāo)可知，熱應(yīng)激期整個牛場的奶牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)。

表5 牛舍環(huán)境溫度與THITable 5 Environmental temperature and THI in the house ofdairy cows

表6 試驗期奶牛直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率表6 The rectum temperature，skin temperature and respiratory rate ofdairy cows in trial period

2.2 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響

2.2.1 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量的影響

奶牛瘤胃液微生物在39.0～39.5℃最活躍，高于此溫度對瘤胃發(fā)酵不利［25］?？梢?，熱應(yīng)激對奶牛瘤胃微生物有一定的影響。由表7可看出，泌乳中、后期組奶牛熱應(yīng)激期的瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量極顯著低于非熱應(yīng)激期(P＜0.01)，而泌乳前期組奶牛熱應(yīng)激前、中、后期及整個熱應(yīng)激期的瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量均極顯著高于非熱應(yīng)激期(P＜0.01)。而且不同泌乳階段組奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，在熱應(yīng)激中期，THI最高時，泌乳前、中期組奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量極顯著高于泌乳后期(P＜0.01)，但在整個熱應(yīng)激期，泌乳前、中期組奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量變化趨勢一致即先升高后降低，而泌乳后期組呈增加趨勢。

表7 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量的影響Table 7 Effects of heat stress on the number of total bacteria in rumen fluid ofdairy cows 106copies/mL

2.2.2 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液厭氧真菌數(shù)量的影響

由表8可看出，泌乳前期組奶牛在熱應(yīng)激前、中、后期及整個熱應(yīng)激期的瘤胃液厭氧真菌數(shù)量均極顯著高于非熱應(yīng)激期(P＜0.01)，但泌乳中、后期組奶牛該指標(biāo)熱應(yīng)激期與非熱應(yīng)激期差異不顯著(P＞0.05)。且同一熱應(yīng)激期不同泌乳階段組奶牛瘤胃液厭氧真菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，但規(guī)律不一致。

表8 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液厭氧真菌數(shù)量的影響Table 8 Effects of heat stress on the number of anaerobic fungi in rumen fluid ofdairy cows106copies/mL

2.2.3 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液纖維分解菌數(shù)量的影響

瘤胃中的纖維降解菌主要包括產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和一些溶纖維丁酸弧菌［26］。

由表9可看出，泌乳前、中期組奶牛熱應(yīng)激期瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量極顯著高于非熱應(yīng)激期(P＜0.01)，而泌乳后期組奶牛瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量則呈相反規(guī)律(P＜0.01)，同一熱應(yīng)激期不同泌乳階段組奶牛瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，但規(guī)律性不一致。

表9 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量的影響Table 9 Effects of heat stress on the number of Bacteroides succinogenes in rumen fluid ofdairy cows 104copies/mL

由表10可看出，泌乳前期組奶牛熱應(yīng)激前、中、后期及整個熱應(yīng)激期瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量均極顯著高于非熱應(yīng)激期(P＜0.01)，而泌乳中、后期組奶牛熱應(yīng)激期的瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量則呈相反規(guī)律(P＜0.01)，且不同泌乳階段組奶牛在同一熱應(yīng)激期的瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，泌乳前期組的白色瘤胃球菌數(shù)量均極顯著高于中、后期(P＜0.01)。

由表11可看出，泌乳前、后期組的奶牛熱應(yīng)激前、中、后期及整個熱應(yīng)激期瘤胃液黃化瘤胃球菌數(shù)量極顯著高于非熱應(yīng)激期(P＜0.01)，且不同泌乳階段組奶牛同一應(yīng)激期瘤胃液黃化瘤胃球菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，但無規(guī)律性。

2.2.4 熱應(yīng)激期奶牛瘤胃液微生物數(shù)量與THI的相關(guān)性分析

由表12可以看出，整個熱應(yīng)激期的THI與泌乳前期組奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量(P＜0.01)、厭氧真菌數(shù)量(P＜0.05)、白色瘤胃球菌數(shù)量(P＜0.01)和黃化瘤胃球菌數(shù)量(P＜0.05)有較強(qiáng)的相關(guān)性，而泌乳中、后期組奶牛的瘤胃液微生物數(shù)量僅泌乳后期組奶牛瘤胃液的黃化瘤胃球菌數(shù)量與THI有極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，其他相關(guān)性均不顯著(P ＞0.05)。

表10 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量的影響Table 10 Effects of heat stress on the number of Ruminococcus albus in rumen fluid ofdairy cows 106copies/mL

表11 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液黃化瘤胃球菌數(shù)量的影響Table 11 Effect of heat stress on the number of Ruminococcus flavefaciens in rumen fluid ofdairy cows 106copies/mL

表12 熱應(yīng)激期奶牛瘤胃液微生物數(shù)量與THI的相關(guān)性分析Table 12 Correlation analysis between microbial number in rumen fluid ofdairy cows and THI in heat stress period

3 討論

3.1 試驗期間牛舍THI的變化

West等［2］認(rèn)為，盡管白天的較高氣溫、相對濕度和輻射使奶牛產(chǎn)生明顯的熱應(yīng)激反應(yīng)，但夜間給予奶牛充足的降溫時間，奶牛仍可耐受較高的白天溫度。Igono等［27］也報道，盡管白天氣溫較高，但只要夜間低于21℃維持3～6 h將降低產(chǎn)奶量的下降程度。其他研究者認(rèn)為，環(huán)境改變與動物反應(yīng)之間存在延遲效應(yīng)，但也有使用當(dāng)天環(huán)境狀況來評價熱應(yīng)激對奶牛生產(chǎn)性能影響的報道［28］。West等［2］報道，在熱天提前 2d 的 THI對當(dāng)天的產(chǎn)奶量的影響最大，且提前2天的氣溫對干物質(zhì)采食量的影響最敏感。前2天平均THI每增加1單位，荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量下降0.88 kg，而干物質(zhì)采食量在環(huán)境溫度每增加1℃時，下降0.85 kg。而本試驗中，熱應(yīng)激期間，即使在夜間，牛舍的平均最低THI仍＞72，奶牛仍然處于熱應(yīng)激狀態(tài)。本試驗同期相關(guān)研究(生理、生產(chǎn)試驗)表明，奶牛熱應(yīng)激時部分指標(biāo)有延遲效應(yīng)，而部分指標(biāo)與當(dāng)天的THI相關(guān)性較強(qiáng)［29］。因此，本試驗采用當(dāng)天的THI來判斷與奶牛熱應(yīng)激的相關(guān)性。

3.2 熱應(yīng)激對奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響

早期的瘤胃微生物研究一般采用50年代Hungate設(shè)計的體外滾管培養(yǎng)法和微生物厭氧培養(yǎng)技術(shù);20世紀(jì)80年代，以核糖體RNA為主的分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速并應(yīng)用于瘤胃微生物的研究;現(xiàn)在人們可以應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)更全面地鑒定瘤胃微生物的種類，完善微生物的分類系統(tǒng)。

瘤胃是一個動態(tài)的、開放的微生態(tài)系統(tǒng)，其微生物區(qū)系主要有細(xì)菌、原蟲及厭氧真菌組成。眾所周知，反芻動物是粗飼料的主要利用者，纖維物質(zhì)主要在瘤胃中被降解和消化，瘤胃的這種強(qiáng)效降解作用是依靠瘤胃微生物來完成的，其中纖維分解菌發(fā)揮著重要的作用。瘤胃中的纖維降解菌主要包括產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和一些溶纖維丁酸弧菌。2種瘤胃球菌是反芻動物瘤胃中降解植物細(xì)胞壁活性最高的革蘭氏陽性菌。白色瘤胃球菌和黃化瘤胃球菌均能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，其中主要是木聚糖酶。產(chǎn)琥珀酸擬桿菌為革蘭氏陰性菌，不運(yùn)動，纖維分解活性很高，是瘤胃纖維分解菌的優(yōu)勢菌株之一，但不能降解木聚糖，其純培養(yǎng)菌具有很強(qiáng)的降解結(jié)構(gòu)性堅韌物質(zhì)(如秸稈)的能力，能夠降解一些黃化瘤胃球菌所不能降解的某些同質(zhì)異晶體纖維素，是研究纖維素酶最早的瘤胃菌株之一［30］。

瘤胃微生物對溫度要求較嚴(yán)格，在39.0～39.5℃時最活躍，高于此溫度對瘤胃發(fā)酵不利。而且瘤胃內(nèi)纖維分解菌對pH也有較嚴(yán)格的要求，pH 6.6 ～7.0 最為活躍，對纖維消化較好［25］，而熱應(yīng)激時，奶牛流涎增多，采食量下降，這必然導(dǎo)致瘤胃的pH變化，造成消化障礙［31］。可見，熱應(yīng)激對奶牛瘤胃微生物有一定的影響，但對每一種微生物的影響不盡一致。Tajima等［28］報道，不同環(huán)境溫度對熱應(yīng)激青年牛瘤胃微生物組成無顯著影響，但受相對濕度和體重影響較大。李旦等［32］報道，熱應(yīng)激對不同個體奶牛間產(chǎn)琥珀酸擬桿菌和黃化瘤胃球菌數(shù)量影響差異較小。王建平等［33］利用實時熒光定量PCR技術(shù)定量6種纖維分解菌數(shù)量的研究結(jié)果表明，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，奶牛瘤胃中黃化瘤胃球菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量變化較大。

本研究結(jié)果中，在熱應(yīng)激條件下，泌乳前期組奶牛的幾種微生物數(shù)量和泌乳后期組的黃化瘤胃球菌數(shù)量及泌乳中期組的產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量均極顯著高于非熱應(yīng)激期。同時，泌乳中、后期組奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量和白色瘤胃球菌數(shù)量及泌乳后期組的產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量則顯著低于非熱應(yīng)激期。這些研究結(jié)果與前人不盡一致，本試驗同期進(jìn)行的生產(chǎn)性能試驗結(jié)果表明，熱應(yīng)激的同一階段及非熱應(yīng)激期條件下，不同泌乳階段的試驗牛采食量無顯著差異，而同一泌乳階段條件下，非熱應(yīng)激期采食量顯著高于熱應(yīng)激期。同時，熱應(yīng)激條件下，泌乳前期的試驗牛揮發(fā)性脂肪酸、氨氮濃度顯著高于泌乳中、后期［29］。所以，泌乳前期與中、后期試驗牛采食量無顯著差異的情況下，由于瘤胃發(fā)酵特性的不同，導(dǎo)致微生物數(shù)量的差異。當(dāng)然還可能與不同泌乳階段奶牛飼糧結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)等差異有關(guān)，有待持續(xù)深入的研究加以驗證說明。

4 結(jié)論

①泌乳前期組奶牛熱應(yīng)激期的瘤胃液各類微生物數(shù)量均極顯著高于非熱應(yīng)激期，但對泌乳中、后期組的各類微生物數(shù)量影響無規(guī)律性。

②熱應(yīng)激THI與泌乳前期組奶牛瘤胃液總細(xì)菌數(shù)量、厭氧真菌數(shù)量、白色瘤胃球菌數(shù)量和黃化瘤胃球菌數(shù)量有較強(qiáng)的相關(guān)性，而THI與泌乳中、后期組奶牛的這些指標(biāo)相關(guān)性較差，說明泌乳前期瘤胃液微生物數(shù)量對熱應(yīng)激的反應(yīng)更敏感。

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