一株鴨源H5N2禽流感病毒全基因組序列分析及對(duì)雞的致病性研究

朱占松，張 曦，崔鵬飛，譚 丹，關(guān)立崢，李文輝，鄧國(guó)華*，陳化蘭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001）

A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科流感病毒屬的成員，根據(jù)其致病性可以分為高致病性（HPAIV）和低致病性（LPAIV）[1]。在過去的30年里，HPAIV H5N2在美國(guó)、墨西哥、意大利都曾大范圍流行過，而我國(guó)香港在1997年、2003年也曾發(fā)生過HPAIV H5N2亞型引起人類感染、死亡的事件[2-3]。特別是在2012年南非和臺(tái)灣H5N2 LPAIV再次爆發(fā)，而野鳥、水禽被認(rèn)為是AIV天然的儲(chǔ)存庫(kù)，并且該病毒可以直接或間接傳播給其他宿主。目前國(guó)內(nèi)也有報(bào)道稱從野鳥體內(nèi)分離到多株H5N2 AIV，同時(shí)基因的突變引起糖基化位點(diǎn)的改變，增加了LPAIV突變?yōu)镠PLAIV可能性[4-5]。因此，對(duì)H5N2 LPAIV的公共衛(wèi)生學(xué)意義予以重視。本研究將從重慶市家禽市場(chǎng)分離的一株鴨源H5N2亞型AIV的基因特性、遺傳演化以及致病性、傳播和復(fù)制能力進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 H5N2病毒分離株來自2012年重慶市活禽市場(chǎng)的正常家禽監(jiān)測(cè)樣品，由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，命名為：A/Duck/CQ/S2036/2012（H5N2）（CQ/036/12）；SPF雞胚及 4周齡SPF雞購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；LS TRIzol RNA提取試劑、RNaseOUT、反轉(zhuǎn)錄酶（MLV）試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DNA測(cè)序試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司。

1.3 病毒的增殖及雞胚半數(shù)感染量（EID50）測(cè)定 將AIV分離株經(jīng)有限稀釋后用11日齡SPF雞胚純化3代，進(jìn)行病毒擴(kuò)增；增殖后的H5N2亞型AIV按10倍倍比稀釋，各稀釋度經(jīng)尿囊腔接種4枚11日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)，48 h后收集尿囊液測(cè)其血凝價(jià)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算EID50。

1.4 全基因組分析

1.4.1 RNA提取與PCR擴(kuò)增采用LS TRIzol試劑提取RNA，應(yīng)用MLV試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Gen-Bank中H5N2亞型AIV各基因片段序列選擇保守性最高的區(qū)域設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4.2 序列測(cè)定與分析PCR產(chǎn)物通過ABI測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序；利用DNA Star軟件中Seqman程序拼接序列，MegAlign進(jìn)行同源性比較；應(yīng)用Meg5進(jìn)行進(jìn)化樹的繪制及分析。

1.5 對(duì)SPF雞致病性試驗(yàn) 按每只100μL含有106EID50病毒經(jīng)鼻腔感染13只4周齡SPF雞，另外兩只接種等量的PBS作為對(duì)照，在負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)，72 h后迫殺3只雞，并采集腦、氣管、胸腺、肝、脾、腎、肺等臟器組織進(jìn)行病毒分離滴定。在感染后連續(xù)7 d采集泄殖腔和喉頭拭子，并接種雞胚通過測(cè)定尿囊液的血凝活性進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。在感染14 d后采集血清，檢測(cè)感染后轉(zhuǎn)陽(yáng)情況。

1.6 對(duì)BALB/c小鼠致病性試驗(yàn) 將病毒稀釋至終濃度為106EID50/50μL，用干冰輕微麻醉后經(jīng)鼻腔感染50μL，感染組8只，對(duì)照組5只；72 h后迫殺3只采集腦、脾、腎、肺、鼻甲5種臟器，臟器勻漿后接種11日齡雞胚進(jìn)行組織病毒含量的滴定，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算其EID50，用于測(cè)定病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制情況。其余組連續(xù)觀察14 d。

2 結(jié) 果

2.1 序列進(jìn)化分析 對(duì)CQ/036/12病毒株全基因組序列的進(jìn)化分析顯示，HA基因全長(zhǎng)1 695 nt，共編碼565個(gè)氨基酸。HA蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列為341R-----TRGLF350共缺失5個(gè)氨基酸，具有低致病AIV的特征。HA蛋白在26位、27位、39位、181位、302位、500位、559位存在7個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，不存在156、170和289位糖基化位點(diǎn)、CQ/036/12株HA基因?qū)儆跉W亞分支，與病毒A/baikal teal/Xianghai/426/2011（H5N2）核苷酸序列同源性最高為97.3%（圖1）。

CQ/036/12病毒分離株NA基因?qū)儆跉W亞分支全長(zhǎng)1 410 nt，共編碼469個(gè)氨基酸，而且無頸部缺失。與病毒A/garganey/Altai/1213/2007（H5N2）核苷酸序列同源性最高為97.7%。68位、199位存在潛在糖基化位點(diǎn)。

內(nèi)部基因序列及進(jìn)化分析顯示，病毒分離株CQ/036/12的內(nèi)部基因均屬于歐亞系、其中M基因與A/duck/Korea/DY104/2007（H4N6）的同源性為99.3%，NP基因與A/pintail/Korea/1173/2009（H7N7）的同源性為98.5%，表明與其它亞型病毒發(fā)生互相重組（表1）。內(nèi)部基因PB2和PA均與A/garganey/Altai/1213/2007（H5N2）的同源性最高。表明該病毒的內(nèi)部基因來源復(fù)雜，可能與韓國(guó)、阿爾山的毒株有著共同的祖先（圖 1）。

2.2 病毒對(duì)SPF雞的感染性試驗(yàn) 病毒分離株CQ/036/12感染SPF雞后，均無明顯臨床癥狀，但從喉拭子和泄殖腔拭子中均能檢測(cè)到病毒，喉拭子排毒期持續(xù)至第7 d，泄殖腔排毒持續(xù)至第5 d，但并不能引起同居雞感染（表2）。CQ/036/12株感染14 d后血清檢測(cè)結(jié)果顯示抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)比例為6/9，同居對(duì)照組雞血清均呈陰性反應(yīng)。同居雞的拭子滴定結(jié)果和血清檢測(cè)結(jié)果一致，表明該病毒不能在雞群之間發(fā)生有效傳播。對(duì)臟器進(jìn)行病毒滴定，試驗(yàn)結(jié)果表明僅在肺臟和氣管中檢測(cè)到病毒，并不能引起雞的全身性感染和在其他臟器內(nèi)有效復(fù)制的能力（表3）。

圖1 CQ/036/12株的基因進(jìn)化樹Fig.1 Phyogenetic tree based on CQ/036/12

2.3 病毒對(duì)BALB/c小鼠的感染性試驗(yàn) 小鼠接種病毒后，并無明顯臨床癥狀，試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)一過性下降，與對(duì)照組相比體重增長(zhǎng)緩慢（圖2），迫殺的3只小鼠臟器病毒滴定結(jié)果顯示，表明病毒僅能在呼吸道內(nèi)復(fù)制，其他臟器未檢測(cè)到病毒（表4）。

表1 毒株CQ/036/12的各基因片段BLAST分析結(jié)果Table 1 The Blast analysis of genes of genes of CQ/036/12 influenze virus isolates

表2 感染后病毒的滴度檢測(cè)結(jié)果Table 2 Virus titration post infection

表3 病毒感染后第3d SPF雞臟器病毒滴度檢測(cè)Table 3 Virus titration of H5N2 viruses in chickens organs on day 3 post inoculation

表4 感染后第3d小鼠臟器病毒滴度檢測(cè)Table 4 Virus titration of H5N2 viruse in mice organs on day 3 post inoculation

圖2 攻毒后兩周內(nèi)小鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Weight change ofmice inoculated with CQ/036/12

3 討 論

2012年國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室在春季監(jiān)測(cè)工作中，從重慶市活禽交易市場(chǎng)中正常家鴨體內(nèi)分離出一株鴨源H5N2亞型禽流感病毒（DK/CQ/036/12）。分別對(duì)SPF雞和BALB/c小鼠的感染性試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示為L(zhǎng)PAIV，這一點(diǎn)與該病毒株的HA基因裂解位點(diǎn)具有典型的LPAIV基因特征相一致。核苷酸同源率分析表明CQ/036/12病毒株的基因均屬于歐亞分支，其全部的基因片段均來自我國(guó)周邊國(guó)家和地區(qū)，同源性均在97%以上，特別是與NP、M兩個(gè)基因同源性最高的分別來自于H7、H4，是一株典型的由不同亞型的病毒株重組而成[5-6]。在SPF雞感染試驗(yàn)中，均未出現(xiàn)任何臨床癥狀，但從病毒的分離復(fù)制結(jié)果顯示，感染雞的喉頭、泄殖腔拭子病毒滴定均為陽(yáng)性，同時(shí)在雞和小鼠的氣管、肺臟中也出現(xiàn)了病毒的復(fù)制，這表明病毒可以在雞體內(nèi)進(jìn)行有效的復(fù)制，對(duì)不同組織有一定的特異嗜性。雖然AIV的致病和組織嗜性的確切機(jī)制目前還不清楚，但很可能由多因素共同作用的結(jié)果，不同器官的唾液酸類型和神經(jīng)氨酸酶的pH穩(wěn)定性可能在決定不同病毒組織嗜性上起決定作用[7-10]。通過動(dòng)物試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)低致病的H5N2亞型AIV雖然不能夠引起家禽的死亡，但卻能夠在家禽體內(nèi)有效的復(fù)制和傳播。而研究已經(jīng)表明致病性H5N2亞型AIV在家禽中流行適應(yīng)后能夠突變?yōu)镠PALV從而造成禽流感暴發(fā)[11-13]。因此，加強(qiáng)對(duì)家禽禽流感的監(jiān)測(cè)與防控對(duì)防制我國(guó)禽流感疫情具有重要意義。

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