亞洲栽培稻與短花藥野生稻種間雜交障礙觀察

傅雪琳，劉向東，盧永根

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

稻屬Oryza 有2 個栽培種和22 個野生種，野生稻蘊含著寶貴的基因資源，其中短花藥野生稻O.brachyantha屬FF 基因組，是稻屬中與亞洲栽培稻O.sativa(AA 基因組)親緣關(guān)系較遠的一個野生稻種［1］，其基因組與亞洲栽培稻基因組明顯不同［2-3］.盡管短花藥野生稻蛋白質(zhì)編碼基因遠少于水稻［4］，但是短花藥野生稻具有對多種水稻病蟲較好的抗性，如抗褐飛虱、螟蟲、稻縱卷葉螟、稻癭蚊以及草叢矮縮病、柱頭外露等［5-6］，是水稻育種重要的遺傳資源.IRRI 通過栽培稻與短花藥野生稻種間雜交，培育了栽培稻品種IR56 背景的短花藥野生稻滲入系，將短花藥野生稻的新白葉枯病抗性基因Xa34 (t)成功轉(zhuǎn)入栽培稻［7-8］.通過雜交，短花藥野生稻對稻縱卷葉螟高的抗性也成功轉(zhuǎn)入栽培稻品種［9］.通過對栽培稻與短花藥野生稻滲入系的分子標記檢測分析，在水稻第6、7、9 和11 號染色體上檢測到1～2 個短花藥野生稻RFLP 標記的滲入，盡管觀察到的滲入水平較低，但這一結(jié)果表明了從遠緣的短花藥野生稻基因組向栽培稻進行染色體片段以及有利基因滲入的可能性［7］.

由于短花藥野生稻與栽培稻屬于不同的基因組，其遺傳分化明顯，種間雜交存在嚴重的生殖障礙，因此，對短花藥野生稻有利基因轉(zhuǎn)移利用研究難度較大，相關(guān)的研究報道極少.已有的報道中栽培稻和野生稻雜種后代的獲得均是通過雜種幼胚拯救途徑獲得［10］，但缺乏對栽培稻與短花藥野生稻種間雜交障礙機理的研究，對克服栽培稻與短花藥野生稻種間生殖障礙有效途徑的探索也鮮見報道.隨著短花藥野生稻全基因組測序的完成［4］，如何有效利用其大量的有利基因改良栽培稻品種成為人們關(guān)注的重要研究領(lǐng)域.因此，弄清楚栽培稻與短花藥野生稻種間生殖隔離機理顯得非常重要，這必將有助于推動通過有性雜交途徑轉(zhuǎn)移利用短花藥野生稻的有利基因的研究進程.本研究利用整體曙紅染色透明激光掃描共聚焦顯微術(shù)(Whole-mount eosin B-staining confocal laser scanning microscopy，簡稱WE-CLSM)對栽培稻與短花藥野生稻雜交后雜種胚胎胚乳發(fā)育及雜種胚囊結(jié)構(gòu)與發(fā)育過程進行了觀察，以期闡明栽培稻與短花藥野生稻種間交配性障礙和雜種雌性不育障礙的細胞學(xué)機理，為探索種間有效雜交體系和方法奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

栽培稻O.sativa 材料為秈稻品種廣陸矮4 號，短花藥野生稻O.brachyantha 為來自IRRI 的種子播種材料Accession No.IRGC 105171.

1.2 雜交配組、花粉萌發(fā)、受精及雜種胚胎胚乳發(fā)育觀察

以廣陸矮4 號為母本、短花藥野生稻為父本配制雜交組合.母本去雄采用剪穎法結(jié)合溫湯殺雄法進行，采用離體雜交方法進行雜交，雜交當日采集正在開花的野生稻的花藥，以捻穗法給母本穗授粉.于授粉后第10—12 天調(diào)查各組合雜交小穗數(shù)、雜種子房膨大數(shù)，計算雜種子房膨大率.

采用苯胺藍溶液染色法［11］觀察短花藥野生稻花粉在母本廣陸矮4 號柱頭上的萌發(fā).取授粉后10～30 min 的雜交小穗，在Leica DMRXA (德國)光學(xué)顯微鏡下進行觀察拍照.統(tǒng)計柱頭上萌發(fā)花粉數(shù)和花粉總數(shù)，計算花粉萌發(fā)率.

采用WE-CLSM 觀察雜交小穗胚胎胚乳發(fā)育.分別在授粉后第1 、3 和7 天用FAA 液固定雜交小穗24 h，以φ(乙醇)為50%的溶液沖洗，后轉(zhuǎn)入φ(乙醇)為70%的溶液4℃冰箱保存.在普通解剖鏡下解剖出子房，經(jīng)φ(乙醇)為70%、50%、30%、10%梯度溶液及蒸餾水進行復(fù)水后(每級間隔20 min)，再用40 g/L 蔗糖曙紅溶液染色10 h，水洗多余染料2～3次，用φ(乙醇)為10%、30%、50%、70%、90%、100%的梯度溶液進行材料脫水(每級間隔20 min)，再經(jīng)無水乙醇脫水2 次后轉(zhuǎn)入1/2 水楊酸甲酯［V(無水乙醇)∶V(水楊酸甲酯)=1 ∶1］整體透明1 h，轉(zhuǎn)入純水楊酸甲酯透明20 min 以上.觀察時將子房放在凹面載玻片上，蓋上蓋玻片，在LeicaSP2激光掃描共聚焦顯微鏡下用543 nm 波長激發(fā)光掃描觀察，并獲取圖像，用Adobe photoshop7.0 處理圖像.

1.3 雜種幼胚培養(yǎng)與植株鑒定

從雜交小穗上剝?nèi)∈诜酆蟮?0—12 天的膨大子房，用φ(乙醇)為70%的溶液對子房表面消毒30 s，無菌水沖洗2 次，再用1 g/L HgCl2表面消毒30 min，無菌水沖洗3～4 次，在超凈工作臺上無菌切取子房基部帶胚部分，并接種到培養(yǎng)基上(25±1)℃暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)出苗.待幼芽長出約2 cm 高時，進行晝夜連續(xù)光照培養(yǎng).3～4 片葉時煉苗移栽.培養(yǎng)基:1/4 MS 培養(yǎng)基+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂.

采用形態(tài)性狀和SSR 標記對雜種進行鑒定.植株形態(tài)性狀調(diào)查參照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所實行的記載標準［12］.SSR 標記鑒定參照Panaud 等［13］的方法.

1.4 雜種胚囊結(jié)構(gòu)與發(fā)育過程觀察

取雜種F1當天開花小穗，剪除穎殼頂部后固定于FAA 固定液24 h 以上.隨后進行脫水、復(fù)水處理，蔗糖曙紅溶液染色，以及激光掃描共聚焦顯微鏡觀察.具體方法同“1.2”雜交小穗胚胎胚乳發(fā)育的觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交小穗發(fā)育與雜種植株獲得

在授粉后第10—12 天，統(tǒng)計雜交組合廣陸矮4號×短花藥野生稻授粉小穗共439 個，其中有104個小穗子房膨大，子房膨大率23.7%.與廣陸矮4 號花后第10 天子房(圖1a)相比，雜種子房瘦癟，未有淀粉充實積累，出現(xiàn)夭亡趨勢(圖1b).離體培養(yǎng)60粒雜種幼胚，獲得植株3 棵，成活2 棵.雜種植株株型較分散，小穗有芒，柱頭外露，落粒性強，這些形態(tài)性狀偏向父本短花藥野生稻(圖1c、1d)，雜種在引物RM186 位點擴增的主帶帶型呈雙親的雜合共顯帶型(圖2)，表明所得雜種為真雜種.

圖1 雜種子房及雜種植株形態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Hybrid ovaries，plantlets and spikes

圖2 雜種及親本在引物RM186 位點的擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplifications of hybrid and parents at the locus of RM186

2.2 雜交小穗受精及雜種胚胎胚乳發(fā)育特點

在給母本穗充足授粉的情況下，觀察短花藥野生稻花粉在廣陸矮4 號柱頭上的萌發(fā)情況.結(jié)果表明，短花藥野生稻的花粉萌發(fā)率為84.3%，花粉管從花粉粒的伸出和向花柱的伸長生長均正常，絕大多數(shù)柱頭上有多條花粉管向花柱和胚珠伸長生長，表明短花藥野生稻花粉能夠在廣陸矮4 號柱頭上正常萌發(fā).取雜交小穗授粉后第1 天和第3 天的胚囊觀察雜交受精情況表明，雜交小穗雙受精率為82.93%，卵細胞單受精率為2.44%，以雙受精為主.該結(jié)果表明栽培稻與短花藥野生稻雜交雙受精率高，受精前障礙不足以影響雜交結(jié)實.

與廣陸矮4 號自交小穗胚胎胚乳發(fā)育過程［14］比較，雜種胚胎胚乳在各發(fā)育階段均出現(xiàn)異?，F(xiàn)象.雜交授粉后第1 天，雜交小穗胚囊內(nèi)胚胎發(fā)育為球形胚的占95.65%(圖3a、3b)，極少數(shù)胚囊內(nèi)游離胚乳核核仁明顯，沿胚囊內(nèi)壁零星分布，表現(xiàn)為正常發(fā)育(圖3a);大多數(shù)胚囊內(nèi)游離胚乳核提早解體，核仁彌散模糊，部分胚囊內(nèi)反足細胞團開始解體(圖3b).雜交授粉后第3 天，雜種胚胎仍呈球形胚，未觀察到梨形胚，胚胎發(fā)育落后或處于停滯狀態(tài)(圖3c、3d)，少數(shù)胚囊內(nèi)游離胚乳核繼續(xù)分裂增殖，游離胚乳核數(shù)目增多，但未形成細胞化的胚乳(圖3c)，多數(shù)胚囊內(nèi)游離胚乳核發(fā)育停滯或解體退化(圖3d).雜交授粉后第7 天，雜種胚胎仍呈球形胚，發(fā)育停滯或開始解體，游離胚乳核未發(fā)生細胞化，并且沿胚囊腔分布的游離胚乳核已在解體(圖3e、3f).由此可見，雜種胚胎胚乳發(fā)育嚴重異常，導(dǎo)致雜種胚在發(fā)育中途夭亡，不能形成正常成熟的雜種種子.

圖3 授粉后第1、3 和7 天雜種胚胎胚乳發(fā)育Fig.3 Development of hybrid embryo and endosperm at 1，3 and 7 days after pollination

2.3 雜種胚囊敗育與發(fā)育特點

共觀察雜種成熟胚囊84 個，全部為結(jié)構(gòu)異常，表現(xiàn)為胚珠內(nèi)無胚囊輪廓或無完整的胚囊腔，在珠心組織內(nèi)胚囊著生位出現(xiàn)退化殘跡，周圍珠心組織也異常解體，最終表現(xiàn)敗育(圖4a).

對雜種胚囊發(fā)育過程進行觀察，其發(fā)育過程也經(jīng)歷了孢原細胞形成期、大孢子母細胞形成期、大孢子母細胞減數(shù)分裂期、功能大孢子形成期、單核胚囊形成期、胚囊有絲分裂期等時期，但是一些主要時期出現(xiàn)異常發(fā)育現(xiàn)象，難以完成發(fā)育過程而形成正常的成熟胚囊.雜種胚囊主要發(fā)育過程的特點表現(xiàn)為:孢原細胞能夠正常啟動形成大孢子母細胞(圖4b、4c);大孢子母細胞減數(shù)分裂期能夠完成減數(shù)分裂過程，形成四分體，但四分體處于異常狀態(tài)，即子細胞不發(fā)育，合點端的子細胞不能進一步發(fā)育為功能大孢子(圖4d);極少數(shù)情況下四分體合點端的子細胞形成功能大孢子，進一步形成單核胚囊(圖4e)，但更多是異常單核胚囊的形成(圖4f);單核胚囊難以進入胚囊有絲分裂期，在珠心組織內(nèi)大孢子母細胞的部位只殘留退化痕跡(圖4h)，附近的珠心組織也隨之解體(圖4i);僅觀察到1 個異常二核胚囊的形成(圖4g).

綜合以上結(jié)果來看，廣陸矮4 號與短花藥野生稻雜種F1胚囊形成和發(fā)育過程嚴重異常，異常發(fā)生的時期主要集中在大孢子母細胞減數(shù)分裂期和功能大孢子形成期，說明大孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂過程不能形成正常的四分體，而四分體的異常直接導(dǎo)致不能形成正常的功能大孢子，這必將導(dǎo)致胚囊不能形成，雜種表現(xiàn)高度的雌性不育.

圖4 雜種敗育胚囊與胚囊發(fā)育過程Fig.4 Abortive embryo sac and the embryo sac development of hybrid

3 討論

由于短花藥野生稻是稻屬基因組最小的一個種［15］，其基因組分化程度高且相對穩(wěn)定，在稻屬進化與分類研究中具有重要而特殊的地位［4］.近年來，對短花藥野生稻基因組特點與分化、以及與亞洲栽培稻等稻屬其他種之間比較基因組研究的報道日益增多，其基因組的組成特點越來越被人們所認識.在短花藥野生稻著絲粒區(qū)存在特異的重復(fù)序列CentO-F，A 基因組和F 基因組存在高度分化［16］;短花藥野生稻著絲粒區(qū)有一個新的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件FRetro3，而且該轉(zhuǎn)座元件在短花藥野生稻基因組以高拷貝數(shù)存在［17］;短花藥野生稻和亞洲栽培稻基因編碼區(qū)核苷酸發(fā)生替換，短花藥野生稻基因組反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的大小和數(shù)量遠小于秈稻基因組，而短花藥野生稻和亞洲栽培稻基因組存在共線性，為利用比較基因組學(xué)探究野生稻的遺傳多樣性并利用其改良栽培稻品種提供了可能［18］.2013年短花藥野生稻全基因組測序完成，表明在短花藥野生稻基因組中包含不到30%的重復(fù)元件，長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活性較低，且有大量的古老長末端重復(fù)元件被刪除，從而導(dǎo)致該基因組維持較小的狀態(tài);短花藥野生稻基因組注釋了32 038個蛋白質(zhì)編碼基因，其中70%定位在對照水稻O.sativa 基因組的共線位置［4］.這為研究和利用短花藥野生稻有利基因提供了重要的信息資源.

隨著對短花藥野生稻基因組測序完成和基因信息的深入了解，如何利用其有利基因創(chuàng)新水稻育種的遺傳資源越來越受到研究者的重視.有性雜交是迄今為止在野生稻有利基因轉(zhuǎn)移利用方面的主要途徑，在栽培稻與非AA 組野生稻種間雜交中雜交不結(jié)實和雜種不育障礙成為一種限制“瓶頸”，嚴重影響了雜交效率和效果［19］.本研究利用激光掃描共聚焦顯微術(shù)對栽培稻與短花藥野生稻雜交后雜種胚胎和胚乳發(fā)育、以及雜種胚囊發(fā)育過程進行了觀察.本研究結(jié)果表明，雜交小穗在母體植株上發(fā)育到一定時期出現(xiàn)雜種胚胎和胚乳發(fā)育停滯并解體，導(dǎo)致雜種不活，適時幼胚拯救可以幫助獲得雜種植株.雜種胚囊高度不育，其原因主要在于大孢子母細胞減數(shù)分裂后不能形成正常的四分體以及正常的功能大孢子，最終導(dǎo)致胚囊不能形成，表現(xiàn)高度雌性不育.通過對雜種進行染色體加倍使得雜種產(chǎn)生2n 雌配子，將能夠提高雜種育性，實現(xiàn)進一步的回交或自交結(jié)實.栽培稻與短花藥野生稻種間生殖隔離機理研究對探索通過有性雜交途徑轉(zhuǎn)移利用短花藥野生稻有利基因提供了指導(dǎo)依據(jù).

［1］VAUGHAN D A.Wild relatives of rice:Genetic resources handbook［M］.Manila:International Rice Research Institute，1994.

［2］ABBASI F M，SHAH A H，PERVEEN F，et al.Genomic affinity between Oryza sativa and Oryza brachyantha as revealed by in situ hybridization and chromosome pairing［J］.Afr J Biotechnol，2010，9(21):3068-3072.

［3］CHANG Kweiduan，F(xiàn)ANG Shaoan，CHANG Fangchi，et al.Chromosomal conservation and sequence diversity of ribosomal RNA genes of two distant Oryza species［J］.Genomics，2010，96:181-190.

［4］CHEN Jinfeng，HUANG Quanfei，GAO Dongying，et al.Whole-genome sequencing of Oryza brachyantha reveals mechanisms underlying Oryza genome evolution［J］.Nat Comms，2013，4:1595-1604.

［5］何光存.野生稻有利基因的挖掘與轉(zhuǎn)移［M］∥羅利軍，應(yīng)存山，湯圣祥.稻種資源學(xué).武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002:279.

［6］BRAR D S，KHUSH G S.Alien introgression in rice［J］.Plant Mol Biol，1997，35:35-47.

［7］BRAR D S，DALMACIO R，ELLORAN R，et al.Gene transfer and molecular characterization of introgression from wild Oryza species into rice［M］∥KHUSH G S.Rice genetics(Ⅲ).Manila:International Rice Research Institute，1996:477-486.

［8］RAM T，LAHA G S，GAUTAM S K，et al.Identification of a new gene introgressed from Oryza brachyantha with broad-spectrum resistance to bacterial blight of rice in India［J］.Rice Genetics Newsletter，2010(25):57-61.

［9］RAMACHANDRAN R，KHAN Z R.Mechanisms of resistance in wild rice Oryza brachyantha to rice leaffolder Cnaphalo crocismedinalis (Guenée)(Lepidoptera:Pyralidae)［J］.J Chem Ecol，1991，17(1):41-65.

［10］BRAR D S，ELLORAN R，KHUSH G S.Interspecific hybrids produced through embryo rescue between cultivated and eight wild species of rice［J］.Rice Genetics Newsletter，1991(8):91-93.

［11］胡適宜.植物胚胎學(xué)實驗方法(五):檢查花粉在柱頭上萌發(fā)和花粉管在花柱中生長的制片法［J］.植物學(xué)通報，1994，11:58-60.

［12］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所.稻屬野生種種質(zhì)資源調(diào)查項目及記載標準［S］.北京:中國科學(xué)院，1986.

［13］PANAUD O，CHEN X，MCCOUCH S R.Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP)in rice (Oryza sativa L)［J］.Mol Genet Genomics，1996，252:597-607.

［14］FU Xuelin，LU Yonggen，LIU Xiangdong，et al.Crossability barriers in the interpsecific hybridization between Oryza sativa L.and O.meyeriana Baill［J］.J Plant Integrative Biol，2009，51(1):21-28.

［15］UOZU S，IKEHASHI H，OHMIDO N，et al.Repetitive sequences:Cause for variation in genome size and chromosome morphology in the genus Oryza［J］.Plant Molecular Biology，1997，35(6):791-799.

［16］LEE H R，ZHANG Wenli，LANGDON T，et al.Chromatin immunoprecipitation cloning reveals rapid evolutionary patterns of centromeric DNA in Oryza species［J］.PNAS，2005，102(33):11793-11798.

［17］GAO Dongying，GILL N，KIM H R，et al.A lineage-specific centromere retrotransposon in Oryza brachyantha［J］.The Plant Journal，2009，60(5):820-831.

［18］ZHANG Shibo，GU Yongqiang，SINGH J，et al.New insights into Oryza genome evolution:High gene colinearity and differential retrotransposon amplification［J］.Plant Molecular Biology，2007，64(5):589-600.

［19］FU Xuelin，LU Yonggen，LIU Xiangdong，et al.Progress on transferring elite genes from Non-AA genome wild rice into Oryza sativa through interspecific hybridization［J］.Rice Science，2008，15(2):79-87.