PCR-DGGE法解析牛糞厭氧發(fā)酵穩(wěn)定期微生物多樣性

夏吉慶，馬添翼，鄭國香，王忠江，康德福，王麗麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著全球新能源開發(fā)利用的深入，大力推進生物質(zhì)能源的轉(zhuǎn)化研究尤為重要，厭氧發(fā)酵便是其中之一。國內(nèi)對于厭氧發(fā)酵中活性污泥微生物的多樣性研究處于起步階段，目前沒有有效方法進行試驗研究[1]?；钚晕勰辔⑸锓N類極其豐富，優(yōu)勢種群及其微生物多樣性在活性污泥生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。因此對厭氧發(fā)酵中活性污泥進行研究分析，具有實際意義。因為采用厭氧發(fā)酵處理牛糞解決環(huán)境污染與提供生物質(zhì)能源方法較少。本研究在開展牛糞兩階段厭氧發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)技術(shù)對通過溢流輸送的發(fā)酵系統(tǒng)并帶有在線活性污泥和發(fā)酵后沼液混合回流的工藝達到穩(wěn)定運行系統(tǒng)中的微生物菌群進行分析，探討菌群的生長特性，為完善厭氧發(fā)酵系統(tǒng)提供參考。

DGGE具有可靠性強、重現(xiàn)性高、方便快捷，可以再現(xiàn)未被培養(yǎng)的微生物信息[2]，解決傳統(tǒng)方法片面性等優(yōu)點。DGGE技術(shù)在分析環(huán)境微生物群落多樣性和動態(tài)性方面迅速得到應(yīng)用。目前證實DGGE技術(shù)在揭示自然界微生物區(qū)系的種群差異和遺傳多樣性等方面具有優(yōu)越性。該技術(shù)已經(jīng)成為微生物群落動態(tài)和多樣性分析的有力工具之一[3-9]。

1 試驗設(shè)計

1.1 試驗工藝

本試驗以牛糞為發(fā)酵原料，對實驗室的厭氧發(fā)酵設(shè)備進行相應(yīng)的改造?？蓪崿F(xiàn)從酸化罐到一級產(chǎn)氣罐、二級產(chǎn)氣罐及后沉池或后儲罐系統(tǒng)中的活性污泥沼液回流和溢流的兩階段（酸化階段和產(chǎn)氣階段獨立設(shè)置）的新型兩步序批式產(chǎn)氣溢流發(fā)酵系統(tǒng)。如圖1所示，料液首先從上部進入酸化罐，由下部流出。再由一級產(chǎn)氣罐的上部進入，由其下部流出。經(jīng)過二級產(chǎn)氣罐時是由其下部進入從上部流出，最后由上部進入后儲罐，主要是利用壓強差實現(xiàn)料液的溢流。

圖1 兩相厭氧溢流發(fā)酵系統(tǒng)裝置Fig.1 Apparatusfor two-phaseoverflow anaerobic fermentation

此系統(tǒng)的特點是大量減少了泵和閥的使用從而能夠降低故障的發(fā)生率。發(fā)酵系統(tǒng)可以將二級產(chǎn)氣罐和后儲罐中的活性污泥通過回流泵按一定比例回流到一級產(chǎn)氣罐的進口處與酸化料液進行混合，從而使酸化料液迅速進入產(chǎn)甲烷氣階段。一級產(chǎn)氣罐和二級產(chǎn)氣罐還可以通過回流泵和閥門的控制實現(xiàn)各自本身的料液循環(huán)進行液體的自身循環(huán)攪拌功能。

本系統(tǒng)通過對系統(tǒng)中的生態(tài)因子（溫度、PH值、進料頻率等）進行控制，以系統(tǒng)產(chǎn)氣率以及產(chǎn)氣甲烷含量等為目標函數(shù)得出最佳污泥回流比、水力停留時間和物料濃度，當系統(tǒng)達到穩(wěn)定運行狀態(tài)時從系統(tǒng)中采集發(fā)酵料液進行菌群生長特性及其動態(tài)特性規(guī)律的研究和分析。

1.2 試驗原料及其工藝性狀

試驗原料為沼液，取自牛糞兩相厭氧發(fā)酵試驗系統(tǒng)的穩(wěn)定產(chǎn)氣階段，研究對象為菌群。該發(fā)酵系統(tǒng)容積為12 m3，中溫30～35℃發(fā)酵，pH值為7.10～7.22，日產(chǎn)氣量為15.6～18.8 m3。

使用PHG-1101型PH/ORP計和SURE1011氣體渦輪流量計記錄的試驗原料的工藝性狀如圖2所示。

圖2 試驗材料的理化性質(zhì)Fig.2 Physicochemical propertiesof Experimental material

1.3 儀器

試驗過程中所用主要試驗儀器為DGGE（美國伯樂），PHG-1101型PH/ORP計（武漢優(yōu)測儀表有限公司），SURE1011氣體渦輪流量計（天津市訊爾儀表有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的處理

為使試驗樣品不受其他菌體的影響，取樣回來后立即放入通風(fēng)處，待變至室溫時再使用，用完后放入冰箱保持0℃不結(jié)冰。

2.2 DNA的提取

取牛糞厭氧發(fā)酵罐中微生物穩(wěn)定期的發(fā)酵液作為樣品。為保證條件的均一穩(wěn)定，將取好的樣品置于5 mL離心管中，4℃保存，最后統(tǒng)一進行基因組DNA提取。

采用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式糞便DNA提取試劑盒進行樣品基因組DNA的提?。ň唧w步驟詳見試劑盒說明書）。采用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其提取效果。結(jié)果表明條帶清晰明亮，DNA提取效果良好。

2.3 PCR擴增

采用引物為1401R GC（5'CGGTGTGTACAA GACCC3'）和968F（5'AACGCGAAGAACCTTAC 3'）對樣品進行PCR擴增。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR圖譜

采用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增效果，如圖3所示。

圖3 擴增效果Fig.3 Graph of expanded results

3.2 樣品PCR擴增產(chǎn)物的DGGE電泳圖譜

結(jié)果見圖4。

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)將PCR擴增后的DNA進行DGGE電泳。電泳結(jié)束后進行銀染，染色后的凝膠用透射掃描儀掃描，獲取的凝膠譜圖如圖4所示。

由圖4可知，牛糞兩相厭氧發(fā)酵的活性污泥中的樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離出了數(shù)目、強度以及遷移位置都不同的條帶。而這些不同位置的條帶代表不同的細菌種群：電泳條帶越多，細菌種群越多；條帶信號越強，該條帶代表的相應(yīng)細菌數(shù)量也越多[11]。由圖4可看出活性污泥中細菌種群較多，優(yōu)勢種群明顯。根據(jù)DGGE圖譜4可以看出，體系微生物群落的變化呈現(xiàn)出以下幾方面特點：降解開始時的圖譜條帶較多，但強度稍弱。隨著降解過程的不斷進行，部分微生物種群逐漸減少，甚至消失，如Band-3，Band-15；有的微生物種群在降解過程中出現(xiàn)波動降解的過程：降解初期數(shù)量較少，而進入降解中期數(shù)量開始逐漸增多，最后降解末期又逐漸減少，如Band-6，Band-7；此外還有一些微生物種群的數(shù)量在降解過程中一直較少，直至降解末期才開始逐漸增多，如Band-2。

圖4 DGGE電泳圖譜Fig.4 DGGEelectrophorogram

3.3 DGGE圖譜條帶的序列比對結(jié)果

將DGGE圖譜上的條帶經(jīng)膠回收后進行連接轉(zhuǎn)化，同時將得到的菌液送上海生工測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行局部同源性比較，比對結(jié)果如表2所示。大多數(shù)條帶的16srDNA序列比對結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中序列的相似度超過95%，由此可以確定試驗結(jié)果中這些條帶代表的微生物與數(shù)據(jù)庫中最相近的微生物屬于同一個屬。

表2 DGGE圖譜中不同條帶的序列比對結(jié)果Table 2 Sequence alignment analysis of DGGE spectrums bands

Verrucomicrobia疣微菌門是一門被劃出不久的細菌。包括少數(shù)幾個被識別的種類，主要被發(fā)現(xiàn)于淡水、海水和土壤環(huán)境、人類糞便中，或者城市固體垃圾填埋滲濾液產(chǎn)甲烷反應(yīng)堆體系中。還有很多未被成功培養(yǎng)的種類是和真核宿主共生的，包括一些原核生物的外共生菌和線蟲動物配子中的內(nèi)共生菌。這種菌生長在極端的厭氧的條件下，將甲烷作為其唯一的能量來源。是一種新型的甲烷氧化菌。Chloroflexi綠彎菌門是在污水處理過程中豐富的生物脫氮除磷菌。經(jīng)常在上流式厭氧污泥床處理高濃度有機廢水中及活性污泥污水處理廠中被發(fā)現(xiàn)。Chloroflexi成員在處理城市污水的MBR的生態(tài)中可以降低膜污染的存在。Acetivibrio sp.多分離于垃圾污泥和豬糞中。成對或鏈排列，運動，中溫生長，最適生長溫度是35℃，化能有機營養(yǎng)，發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乙酸，其他可能的產(chǎn)物有乙醇、CO2和H2，但不產(chǎn)生丙酸和乳酸。解纖維醋弧菌(Acetivibriocellulolyticus)對于發(fā)酵液中的不良環(huán)境有較好的耐受和調(diào)節(jié)能力，對揮發(fā)酸的生成起著重要作用。Lentisphaerae是黏膠球形菌門。Deltaproteobacteria出菇體形成的粘細菌在不利的環(huán)境釋放myxospores，并嚴格厭氧屬，其中包含大部分已知的一個分支硫酸鹽（脫硫，Desulfobacter，Desulfococcus，Desulfonema等）和硫還原菌（如Desulfuromonas SPP）。以及其他幾個具有不同的生理厭氧細菌。

從表3可以看出，微生物種類繁多，而且涉及黏膠球形菌門、β-變形菌綱、疣微菌綱等多個菌綱，同時也說明了微生物群落組成的多樣性。

4 結(jié)論

a.利用分子生物學(xué)技術(shù)PCR-DGGE分析了兩相厭氧溢流發(fā)酵工藝穩(wěn)定期時的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，具有溢流輸送發(fā)酵系統(tǒng)并結(jié)合在線活性污泥和發(fā)酵后沼液混合回流的反應(yīng)系統(tǒng)可以穩(wěn)定可靠的運行。

b.DGGE圖譜顯示，活性污泥微生物穩(wěn)定期細菌種群較豐富，優(yōu)勢種群明顯，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

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