微波輔助提取枳殼中柚皮苷、新橙皮苷的工藝研究

劉學(xué)仁， 蔡品品， 姜 濤， 向顯智， 呂鑒泉*

(1.湖北省黃岡市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖北 黃岡 438000;2.湖北師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北黃石 435002)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種干燥未成熟果實(shí)。枳殼性微寒，味苦、辛、酸、溫，入脾、胃經(jīng)。具有理氣寬中，行氣消滯等功能;用于胸肋氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停，胃下垂，脫肛，子宮脫垂等癥。枳殼中化學(xué)成分主要有黃酮類、揮發(fā)油及少量生物堿等，其中黃酮類成分中又以柚皮苷 (Naringin)和新橙皮苷 (Neohesperidin)等成分，是枳殼理氣、行滯、祛痰和平喘的主要藥理成分。柚皮苷和新橙皮苷具有廣泛的生物活性和藥理作用，能調(diào)節(jié)和干預(yù)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等系統(tǒng)的生理功能和病理變化，也具有抗腫瘤、抗基因突變、抗菌和微生物、抗炎和抗過敏等作用;可以通過競爭性抑制來提高其他藥物的生物利用度，等等［1］。

目前對枳殼黃酮類成分提取和分離方法研究，主要有水浴回流提取法［2］、醇或堿液提酸沉法［3］、索氏提取法［4］、超聲輔助提取法［5］和超臨界流體萃取法［6］等方法。這些提取和分離方法也各有優(yōu)點(diǎn)，但同時也存在或耗能、耗時、耗溶劑，或產(chǎn)率不高，或設(shè)備要求高等缺點(diǎn)。采取微波輻射進(jìn)行提取分離，可以克服上述缺點(diǎn)，同時具有效率高、選擇性強(qiáng)、節(jié)省時間、節(jié)省溶劑、節(jié)能、污染小等優(yōu)點(diǎn)，目前已應(yīng)用到包括黃酮在內(nèi)的幾大類天然化合物的提取與分離［7-8］。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，采取在常壓條件下用微波萃取枳殼中的柚皮苷和新橙皮苷，考察溶劑、微波萃取功率、提取時間、溫度等因素對枳殼中柚皮苷、新橙皮苷提取效果的影響，找出最佳提取工藝條件，為枳殼中黃酮成分的提取分離提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

DIONEX型高效液相色譜儀 (Dionex戴安儀器公司)，包括P680高壓泵、PDA—100檢測器、TCC—100柱溫箱、ASI—100自動進(jìn)樣器。XH—100A微波催化合成/萃取儀(北京市祥鵠科技發(fā)展有限公司);SartoriusCP225D十萬分之一電子分析天平;AB104—N型電子分析天平。

對照品柚皮苷 (中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200620，純度100%)、新橙皮苷 (西安旭煌技術(shù)有限公司，批號N-100302，純度98%)。液相用乙腈、甲醇均為色譜純，提取用甲醇為分析純，水為超純水。

枳殼樣品購于安徽亳州藥材專業(yè)市場。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 Dikma C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);乙腈-水 (20∶80)(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3)為流動相;進(jìn)樣體積20 μL;檢測波長283 nm;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥至恒定質(zhì)量的柚皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品各3.0 mg，置25.00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得分別含柚皮苷和新橙皮苷120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時，精密取5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10.00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得分別含柚皮苷和新橙皮苷60 μg/mL工作溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取枳殼樣品粗粉0.2 g，置于100 mL三頸燒瓶中，精密加入相應(yīng)的溶劑50.00 mL，密塞，稱定質(zhì)量。將三頸燒瓶放入微波爐腔室中，接好裝置，接通冷凝水，設(shè)置各參數(shù)，開啟微波。萃取完成后，取出三頸燒瓶放置至室溫，稱定質(zhì)量，用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別取1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL柚皮苷和新橙皮苷的工作溶液注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行色譜分析。以進(jìn)樣質(zhì)量對峰面積進(jìn)行線性回歸，作出校正曲線。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=28.217X－0.381 7(r=0.997 8，n=5)，線性范圍為0.062 8×10－6～1.256×10－6g;新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=32.922X－0.269 0， (r=0.999 4，n=5)，線性范圍為0.072 4×10－6～1.448 0×10－6g。見圖1。

圖1 枳殼 (A)、新橙皮苷 (B)、柚皮苷 (C)HPLC色譜圖

2.2.2 精密度試驗(yàn) 分別吸取柚皮苷和新橙皮苷的工作溶液各20 μL，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣6次，測定峰面積，柚皮苷的RSD值為0.8%(n=6);新橙皮苷的RSD值為0.9%(n=6)。結(jié)果表明，此方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱樣品粗粉0.1 g共6份，按2.1.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品，按上述色譜條件，每份分別進(jìn)樣2次進(jìn)行測定。測定該枳殼樣品中含柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.32%，RSD值為1.1%(n=6);含新橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.48%，RSD值為1.3%(n=6)。表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密取枳殼樣品0.152 8 g，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，分別在0、1、6、12、18、24 h進(jìn)樣測定。測定峰面積，柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.27%，RSD值為0.9% (n=6);新橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.33%，RSD值為0.5%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已測定 (含柚皮苷和新橙皮苷分別約為4.32%和2.48%)的枳殼樣品粗粉約0.1 g共6份，在每一份中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷約4.8 mg和新橙皮苷約2.5 mg，按2.1.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品，按上述色譜條件，分別取20 μL進(jìn)樣，照樣品測定項(xiàng)下進(jìn)行測定。測定該枳殼樣品中加樣回收率柚皮苷為92.7%，RSD值為2.0%(n=6);新橙皮苷為88.7%，RSD值為2.3%(n=6)。表明本方法準(zhǔn)確度較好。

表1 加樣回收試驗(yàn) (n=6)

2.3 樣品的測定

2.3.1 萃取條件的正交優(yōu)化 選取溶劑、微波萃取儀功率、提取時間和提取溫度為考察因素，以測得的柚皮苷和新橙皮苷量為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)L9(34)，選取最佳提取工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平L9(34)

2.3.2 測定結(jié)果與分析 正交實(shí)驗(yàn)9個實(shí)驗(yàn)，每個實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)，共取枳殼樣品18個，每個樣品取枳殼粗粉約0.2 g，以3個樣品為一組，按2.1.3項(xiàng)供試品溶液的制備和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相應(yīng)條件分別進(jìn)行處理、測定每組柚皮苷和新橙皮苷的量的平均值。測定結(jié)果及結(jié)果分析見表3。

由表3可知各實(shí)驗(yàn)因素及其因素水平對枳殼中柚皮苷和新橙皮苷的提取量大小的影響表現(xiàn)出一定的差異。無論是對柚皮苷還是新橙皮苷的提取，4因素的極差R值的大小排序基本為A＞B＞D＞C;而且4個因素中，溶劑因素的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3個因素的影響。提取的優(yōu)化條件為:80%乙醇作溶劑，微波萃取儀功率400 W，時間10 min，溫度40℃，即A2B2C2D2。同時就極差R大小來看，各實(shí)驗(yàn)因素及其因素水平對柚皮苷的提取影響比對新橙皮苷的影響更大。分析其可能的原因，一是可能柚皮苷和新橙皮苷在微波作用下熱穩(wěn)定性不同;另一個可能的原因是兩者的溶解度有一定的差異。

用方差分析對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，考察其顯著性，分析結(jié)果見表4。

以柚皮苷為考察對象，誤差為最小的離差平方和0.54，自由度為2+2=4，F(xiàn)0.05(2，4)=6.94。由表6可知，F(xiàn)A=7.69＞F0.05(2，4)=6.94，所用溶劑為顯著影響因素;F0.05(2，4)=6.94＞FB=1.24＞FD=1.15＞FC=1.00，微波萃取儀功率、萃取時間、萃取溫度均為不顯著因素。以新橙皮苷為考察對象，由表4可知，誤差為最小的離差平方和0.08，自由度為 2+2=4，F(xiàn)0.05(2，4)=6.94;FA=9.50＞F0.05(2，4)=6.94;F0.05(2，4)=6.94 ＞FB=1.62 ＞FD=1.50＞FC=1.00，也得到所用溶劑為顯著影響因素，微波萃取儀功率、萃取時間、萃取溫度均為不顯著因素。從方差的觀點(diǎn)來看，無論是對柚皮苷還是對新橙皮苷，微波輔助提取的優(yōu)化條件均為A2B2C2D2，即80%乙醇作溶劑，微波萃取儀功率400 W，時間10 min，溫度40℃;只是各因素對柚皮苷和新橙皮苷影響的程度有一定的差別。分析其原因可以得到與直觀分析一致的結(jié)論。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析

表4 方差分析

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助提取的方法，對枳殼中柚皮苷和新橙皮苷提取條件進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是對柚皮苷還是新橙皮苷，微波提取的優(yōu)化工藝條件是:80%乙醇作溶劑，微波萃取儀功率400 W，提取時間10 min，提取溫度40℃。與回流提取法的2 h相比，提取時間大大縮短，效率有了明顯的提高。與索氏提取、超聲輔助提取等方法比，也降低了提取溫度，保證了黃酮成分熱穩(wěn)定性的要求;同時優(yōu)選80%乙醇作提取溶劑，可以降低其他有機(jī)溶劑殘留毒性。與文獻(xiàn)比較［9］，所獲得的優(yōu)化工藝條件有的參數(shù)是相同的，也有些參數(shù)有一定的差別，這是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)置的因素和水平不同所致。本實(shí)驗(yàn)同時考察枳殼中成分量比較高的兩種成分，更能反映優(yōu)化工藝條件的意義。此方法簡便、準(zhǔn)確、可靠、快速、實(shí)用，對正確評價枳殼中黃酮成分的內(nèi)在品質(zhì)以及蕓香科其他天然藥物中功能性成分的提取、分離及分析方法的建立具有一定的參考與借鑒作用。

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