漢麻果膠不同提取物的體外抗菌活性研究

陳本超， 蔡光明， 袁 野， 李婷婷， 韓素貞， 何 群

(1.解放軍第302醫(yī)院中藥研究所，北京 100039;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410007;3.首都師范大學(xué)，北京 100048)

漢麻Cannabis sativaL.是大麻科Cannabinaceae大麻屬Cannabis一年生草本植物［1］，是我國最早的作物之一，具有悠久的種植歷史，主要包括纖維用漢麻、藥用漢麻和野生漢麻三大類。漢麻在我國不同地區(qū)有不同的稱謂［2］，如線麻、火麻、寒麻、魁麻和大麻。國際上四氫大麻酚(THC)量低于0.3%的品種稱為工業(yè)大麻 (Industrial Hemp)，高于0.3%［3］的稱為藥用大麻［4-5］(marijuana)和毒品大麻［6］(hashish)。人類吸食大麻的歷史長(zhǎng)達(dá)千余年，20世紀(jì)在毒品和宗教方面的使用有增加傾向。由于近年來，科學(xué)家開發(fā)了低毒漢麻，其漢麻纖維主要用于紡織等領(lǐng)域，這些使得漢麻的應(yīng)用加以拓展。漢麻纖維是漢麻的主要產(chǎn)品，研究發(fā)現(xiàn)漢麻纖維具有明顯的抗菌作用，并且其抗菌作用可能與漢麻纖維中的某些酚類成分有關(guān)［7-10］。漢麻果膠作為漢麻脫膠的副產(chǎn)物往往被丟棄掉，污染環(huán)境。但是在工人處理漢麻莖稈脫膠過程中，發(fā)現(xiàn)漢麻果膠水浸液對(duì)皮膚感染部位有較好的治療作用。通過前期實(shí)驗(yàn)研究，本課題組對(duì)漢麻果膠中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，確定其中含有生物堿、黃酮、皂苷、多糖、甾體、萜類、鞣質(zhì)或酚類、蒽醌類和揮發(fā)油等成分［11］，并測(cè)得漢麻果膠總皂苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.36%［12］，在經(jīng)過大孔樹脂純化后的洗脫物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例高達(dá)50%［13］。與漢麻果膠相關(guān)的抗菌實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬采用國內(nèi)已經(jīng)培育出優(yōu)良的無毒或者低毒漢麻工業(yè)品種脫膠后的產(chǎn)物即作為研究對(duì)象，采用管碟法和微量液基稀釋法研究其體外抗菌活性，并篩選其抗菌活性部位，為漢麻果膠的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 受試菌株 大腸埃希菌Escherichia coli［CMCC(B)44103］，金 黃 色 葡 萄 球 菌Staphyloccocusaureus(ATCC29213)，單核增生李氏特菌Listeria monocytogenes［LM CMCC(B)54002］，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC(B)63501］，蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus［CMCC(B)63301］，普通變形桿菌Proteus vulgaris［CMCC(B)49027］，傷寒沙門氏菌Salmonella typhi(ATCC 14028)均由首都師范大學(xué)微生物系提供;紅色毛癬菌Trichophyton rubrum(BMU01672)，須癬毛癬菌Trichophyton mentagrophytes(ATCC 28185)，犬小孢子菌Microsporum canis(ATCC 22019)，白色念珠菌Candida albicans［CMCC(B)98001］由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心提供包藏菌株。

1.2 試驗(yàn)用藥物、器材 D101樹脂 (天津海光樹脂有限公司);AB-8、SP-70樹脂 (日本三菱化學(xué)，日本)，DMSO(amresco公司，美國)，0.22 μm微孔濾膜，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖酚紅牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液 (含葡萄糖1%、酚紅0.002%);馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)，燕麥培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂 (SDA)以上材料來自北京科昊澤生物技術(shù)有限公司。所用試劑均為分析純。

1.3 受試藥物制備 將經(jīng)過干燥處理的漢麻果膠粉20 kg，加80%乙醇回流提取3次，加樣量分別為5倍、4倍、3倍。濃縮回收乙醇，至無醇味，靜置24 h以上，除去下層葉綠素層，保留上層溶液。將溶液稀釋至一定體積，分別上D101、AB-8、SP-70樹脂并分別用水、30%、70%、80%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥成固體狀備用。

表1 不同樹脂不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物標(biāo)記

2 方法

2.1 藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度測(cè)定 稱取9個(gè)樣品各8.0 mg溶于2 mL DMSO中 (質(zhì)量濃度為4 000 μg/mL)經(jīng)0.22 μm的過濾器除菌后保存在4℃冰箱備用。

將配制好的供試藥物原液用的牛肉膏蛋白胨體培養(yǎng)基從第1管至第9管進(jìn)行二倍稀釋，稀釋倍數(shù)分別為1∶2、1∶4、1∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256、1∶512，置于35℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18～24 h后取出。分別將濃度為1×106CFU/mL的指示菌菌懸液各100 μL涂在制備好的牛肉膏蛋白胨平板上，在涂好的平板上放入4只牛津杯 (內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm)，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入待檢樣品，其中3只加同濃度的同種樣品各200 μL，第4只牛津杯中加入200 μL溶劑。將涂好的平板放入35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后取出觀察平板中牛津杯周圍是否有抑菌圈，并對(duì)有抑菌圈的牛津杯用游標(biāo)卡尺測(cè)定記錄，抑菌圈的大小表明藥物對(duì)細(xì)菌的抑制作用的強(qiáng)弱。

取無菌試管 (13 mm×100 mm)12支，排成一排，每管加入葡萄糖酚紅牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液1 mL，在第1管加入藥物原液 (4 000 μg/mL)1.0 mL混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第10管，并從第10管中吸取1 mL棄去，第11管只加1 mL溶劑作為溶劑對(duì)照組，第12管為不加藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1 mL，使每管最終菌液濃度約為1×106CFU/mL。第1管至第10管藥物質(zhì)量濃度分別為2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9 μg/mL。將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育18～24 h;細(xì)菌生長(zhǎng)使葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，與酚紅指示劑反映變黃，陽性管為黃色;無細(xì)菌生長(zhǎng)，試管中液體仍為澄清透明紅色者陰性管。以肉眼觀察不到菌落生長(zhǎng)的最高藥物稀釋濃度為該樣品對(duì)該種細(xì)菌的最小抑菌濃度 (MIC)。

取觀察仍為澄清透明紅色者測(cè)定管的MIC陰性管中培養(yǎng)液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，35℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。觀察記錄菌落數(shù)。菌落數(shù)＜3或無菌生長(zhǎng)的最低濃度即為漢麻樣品的最低殺菌濃度 (MBC)。

2.2 藥物對(duì)真菌的最小抑菌濃度測(cè)定 稱取以上9個(gè)樣本各6.4 mg溶于2 mL二甲基亞砜 (DMSO)中 (質(zhì)量濃度為3 200 μg/mL)，經(jīng)0.22 μm的過濾器除菌后保存在4℃冰箱備用。取3 200 μg/mL的各樣本，用RPMI-1640培養(yǎng)基先稀釋50倍后得到64 μg/mL的樣品，然后再進(jìn)行兩倍稀釋，得到稀釋終質(zhì)量濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06 μg/mL，10個(gè)質(zhì)量濃度。分別將各質(zhì)量濃度的藥物加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。1～10列為藥物各質(zhì)量濃度，11列為生長(zhǎng)對(duì)照，12列為空白對(duì)照以及溶媒對(duì)照。

皮膚癬菌在PDA上培養(yǎng)7～10 d;紅色毛癬菌在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d;白色念珠菌在SDA上培養(yǎng)24～48 h。用0.9%生理鹽水沖洗皮膚癬菌落表面，取菌懸液于試管中，沉降10 min左右，取上清比濁儀計(jì)數(shù)為0.5麥?zhǔn)蠞岫?(相當(dāng)于1×105～5×105CFU/mL)，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋100倍的最終菌懸液濃度為1×103～5×103CFU/mL;白色念珠菌比濁儀計(jì)數(shù)為0.5麥?zhǔn)蠞岫?(1×106～5×106CFU/mL)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋2 000倍的最終菌懸液濃度為0.5×103～2.5×103CFU/mL。取100 μL菌懸液加入配制好的藥敏板1～11列中。35℃溫箱培養(yǎng)。皮膚癬菌4～6 d觀察結(jié)果，白色念珠菌24～48 h觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)細(xì)菌的抑菌圈 將放有牛津杯的牛肉膏蛋白胨平板取出，觀察牛津杯周圍是否有抑菌圈，然后用游標(biāo)卡尺量抑菌圈的直徑，結(jié)果見表2。

從抑菌圈結(jié)果上看出，在70%乙醇洗脫3種樹脂的洗脫物有較好的抗細(xì)菌活性，其中以AB-8樹脂下洗脫物抗菌譜廣。

3.2 最小抑菌質(zhì)量濃度 (MIC) 結(jié)果見表3～4。

從表4中可以看出C1的抑制真菌生長(zhǎng)的效果是最好的，除A1、A2、A3對(duì)犬小孢子菌不敏感外，而其余的抑菌作用均明顯，以C1的抑制作用最強(qiáng)。

3.3 最低殺菌質(zhì)量濃度 (MBC) 結(jié)果見表5。從表5可以看出，A1對(duì)大腸桿菌殺菌效果最好，C1對(duì)臘狀芽胞桿菌具有殺菌作用，但是作用不明顯，而B1對(duì)變形桿菌和沙門氏菌殺菌作用較明顯。

表2 樣品對(duì)各細(xì)菌抑菌圈直徑的大小 (±s，n=3)

表2 樣品對(duì)各細(xì)菌抑菌圈直徑的大小 (±s，n=3)

注:“－”代表無抑菌圈。與陰性對(duì)照比較，＊＊P＜0.001。*在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上發(fā)現(xiàn)，樣品A2、A3、C2、C3并未有明顯的抑菌圈，故在表格中省略。

樣品*抑菌圈直徑大小/mm大腸桿菌 變形桿菌 傷寒桿菌 枯草芽胞桿菌 金黃色葡萄球菌 單核增生李斯特菌 蠟樣芽孢桿菌A1 14.1 ±1.2＊＊ － － － － － －B1 － 15.4 ±3.3＊＊ 17.2 ±2.5＊＊ 11.8 ±2.3＊＊ － 18.4＊＊±2.6 15.4 ±2.6＊＊B2 11.3 ±2.2＊＊ 17.8 ±2.8＊＊ 18.7 ±3.1＊＊ 13.9 ±1.4＊＊ － 13.7＊＊±2.7 14.2 ±2.2＊＊B3 － 17.2 ±2.4＊＊ 12.3 ±2.1＊＊ 11.7 ±2.7＊＊ － － －C1 － － － － － － 11.2±1.9＊＊陰性對(duì)照 － － － － － － －

表3 樣品對(duì)G－和G+的最小抑菌濃度 (MIC)

表4 樣品對(duì)真菌的最小抑菌濃度 (MIC)

表5 樣品對(duì)G－和G+的最小殺菌濃度 (MBC)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用了4種革蘭氏陽性菌和3種革蘭氏陰性菌做抗細(xì)菌篩選實(shí)驗(yàn)，抗真菌部位的篩選采用了淺表部皮膚真菌感染致病菌的紅毛癬菌和須毛癬菌以及犬小孢子菌，這3種真菌均在皮膚真菌感染中占有很大比例［14-17］，深部感染的采用白色念珠菌作為篩選菌株的代表，這些常見菌株作為活性篩選載體，能更好的評(píng)價(jià)該提取物的抗菌活性。

漢麻果膠處理過程中，為了富集成分，除去鞣質(zhì)葉綠素等物質(zhì)，采用醇沉、大孔吸附樹脂吸附等方法。篩選乙醇洗脫濃度的過程中采用化學(xué)手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30%乙醇洗脫和70%洗脫明顯不同，其黃酮或者皂苷量也有差別;70%乙醇洗脫物中黃酮量高于50%乙醇洗脫物，但兩者所含有的黃酮類化合物或者苯丙素類化合物類別相接近;在80%或80%以上乙醇洗脫時(shí)，其洗脫物中皂苷量高于70%乙醇洗脫，洗脫物中的化學(xué)成分具有明顯差別。故本實(shí)驗(yàn)中采用30%、70%、80%乙醇洗脫來研究不同極性部位的活性物質(zhì)。

本研究顯示，30%乙醇洗脫物對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，推測(cè)可能與其中所含的酚類、有機(jī)酸物質(zhì)有關(guān)。前期化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示70%乙醇洗脫其總黃酮的量高達(dá)50%，預(yù)示著可能跟其中所含的黃酮類、苯丙素類的成分、含有量相關(guān)。同樣，80%乙醇洗脫物中化學(xué)測(cè)定其總皂苷量較高，對(duì)淺表部真菌感染菌株的抑制作用較強(qiáng)。3種樹脂在70%乙醇洗脫下，其洗脫液對(duì)所測(cè)的大部分細(xì)菌均有抑制作用，顯示出該部位的抗菌譜廣，也證實(shí)了70%乙醇洗脫為抗細(xì)菌活性部位有效洗脫體積分?jǐn)?shù)。對(duì)皮膚癬菌的抗真菌活性部位集中在80%洗脫液中，這為下一步研究不同部位活性物質(zhì)提供了一個(gè)重要參考依據(jù)。

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