疏肝和胃顆粒對反流性食管炎大鼠平滑肌細胞收縮和血漿胃泌素、胃動素等的影響

王學習， 路 莉， 李少海， 千維娜， 王 艷， 祁永福， 趙健雄

(1.蘭州大學中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅蘭州 730000;2.蘭州大學藥理研究所，甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，甘肅蘭州 730000)

胃食管反流病 (Gastroesophageal reflux disease)是一種復發(fā)頻率很高的慢性難治性疾病，目前采用抑酸藥物、促胃動力藥物等對癥治療，短期療效較好，但停藥后易復發(fā)，長期用藥患者依從性較差［1］。疏肝和胃顆粒 (湯)(專利號:200710017349.6)經(jīng)臨床驗證，對反流性食管炎 (Reflux esophagitis)治療已取得肯定的臨床療效［2］，動物實驗表明，它可以降低反流性食管炎大鼠胃和食管pH值、改善食管炎性病理損傷、抑制黏膜增生［3］，其抗炎機制與調(diào)節(jié)人白介素23/人白介素17(IL-23/IL-17)炎癥軸［4］和叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4(FOXO4)信號通路［5］相關(guān)。為進一步探討疏肝和胃顆粒對反流性食管炎大鼠的治療作用及機制，進行其對胃平滑肌細胞收縮和胃腸激素水平影響的實驗研究。

1 材料

1.1 試驗藥物 疏肝和胃顆粒(專利號:200710017349.6)處方組成及比例:柴胡10份、白芍15份、枳殼10份、姜半夏10份、陳皮10份、烏賊骨15份、黃芩10份、郁金10份、木香5份、生甘草5份，委托蘭州佛慈制藥廠加工生產(chǎn)，制備工藝為藥材加8倍量水，浸泡1 h，提取3次，1 h/次，生產(chǎn)批號:09-05-10，臨用前用生理鹽水配制成含生藥1.08 g/mL。

奧美拉唑膠囊，20mg/粒，魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H19990317。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量 (220±20)g，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(甘)2004-2006-0000449。

1.3 試劑 Ⅱ型膠原酶、大豆胰蛋白酶抑制劑，Sigma公司;胃泌素 (GAS)、胃動素 (MTL)放免試劑盒，解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供;血管活性腸肽 (VIP)放免試劑盒，北京華英放免技術(shù)研究所。

1.4 儀器 JEM100B型透射電鏡，美國BECTONDISCKINSON公司產(chǎn)品;CK—4032PH型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司;全自動放免測定儀，中國科技大學中佳公司。

1.5 方法

1.5.1 造模 健康SD大鼠，適應(yīng)性觀察1周，行半幽門結(jié)扎聯(lián)合賁門肌切開術(shù)復制反流性食管炎模型［3］。另取動物行假手術(shù)，即開腹后不進行任何手術(shù)操作關(guān)腹。所有動物禁食48 h，再行觀察1周，剔除異常動物。

1.5.2 含藥血清制備 取反流性食管炎模型大鼠分為模型組 (生理鹽水)、奧美拉唑組 (奧美拉唑，8.7 mg/kg)和疏肝和胃顆粒組 (疏肝和胃顆粒，10.8 g/kg)，每組動物雌雄各半，所有動物等體積灌胃給藥，每日2次，共3 d。于末次灌胃后2 h腹主動脈采血，分離血清，同組動物血清混合，0.22 μm微孔濾膜無菌過濾后，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 食管、胃平滑肌細胞的制備及細胞收縮反應(yīng)的測定 參考文獻方法制備游離的大鼠食管［6］、胃平滑肌細胞。取造模成功1周未治療反流性食管炎大鼠，實驗前24 h禁食不禁水，剝?nèi)∈彻?、全胃，HEPEs緩沖液中分別取食管下括約肌 (胃賁門與食管相連處呈壺腹狀膨大且黏膜增厚、肌纖維呈環(huán)形排列的節(jié)段)、胃體 (距賁門約0.5 cm)、胃竇 (距幽門約0.5 cm)和幽門4個部分，剪成1～2 mm3的小肌塊，31℃孵育消化2次，30 min/次，過濾，緩沖液洗。重懸肌塊于HEPEs緩沖液中，31℃振蕩30 min，500 μm尼龍網(wǎng)過濾，收集單個平滑肌細胞，調(diào)整細胞密度1×105/mL。臺盼藍檢查細胞活性，實驗要求成活細胞在90%以上。整個操作過程液體中均通O2。

取0.27 mL預(yù)熱細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，加入0.09 mL含藥血清，31℃孵育60 s，加入0.10 mL 2.5%戊二醛終止反應(yīng)。每組設(shè)10復孔。每個樣本倒置顯微鏡下隨機測量20個細胞長軸作為該樣本細胞長度。細胞的收縮反應(yīng)是平滑肌細胞長度在加入藥物或含藥血清后出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象，可以用縮小多少微米表示或者以給予藥物或含藥血清前后細胞縮小變化的百分數(shù)來表示。細胞收縮變化百分數(shù)=［(對照組細胞平均長度值－給藥組細胞平均長度值)/對照組細胞平均長度值］×100%

1.5.4 動物實驗分組與給藥 造模動物隨機分為模型組(生理鹽水)、奧美拉唑組 (奧美拉唑，8.7 mg/kg)、疏肝和胃顆粒組 (疏肝和胃顆粒，10.8 g/kg)，假手術(shù)動物設(shè)為假手術(shù)對照組 (生理鹽水)，另取正常動物作為正常對照組 (生理鹽水)，每組10只。所有動物等體積灌胃給藥，2 mL/200 g，1次/d，連續(xù)28 d。

1.5.5 標本采集 治療結(jié)束后，動物腹主動脈取血，分裝于2個一次性塑料試管內(nèi)，一份標本2 mL用于分離血清，余注入含10%EDTA-Na2及抑肽酶的4℃預(yù)冷試管內(nèi)分離血漿備用。取1 mL血漿加入4℃預(yù)冷丙酮2 mL，混勻，1 500×g低溫離心15 min，取上清液，揮干丙酮后低溫冷凍干燥，用于VIP檢測。

采血后處死動物，剝?nèi)∈彻埽庋鄞篌w觀察黏膜損傷情況，后將食管分為2份，分別用4%甲醛和3%戊二醛固定。

1.5.6 大鼠食管黏膜組織病理學觀察 取甲醛固定食管組織，常規(guī)切片HE染色，光鏡下觀察食管組織病理學改變，包括食管組織鱗狀上皮增生和黏膜固有層中性粒細胞、淋巴細胞浸潤情況等。

取戊二醛固定食管組織，制作切片，在電鏡下觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)，主要包括上皮細胞結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)細胞器結(jié)構(gòu)、細胞之間橋粒連接結(jié)構(gòu)及細胞間隙等。

1.5.7 胃腸激素水平檢測 取分離備用血清，放免法檢測GAS水平;取分離備用血漿，放免法檢測MTL;取經(jīng)丙酮處理血漿凍干品放免法檢測VIP檢測。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對胃食管平滑肌細胞收縮反應(yīng)的影響 疏肝和胃顆粒含藥血清孵育可以引起來源于食管下括約肌、胃體、胃竇和胃幽門部位平滑肌細胞收縮，引起平滑肌細胞長軸長度縮短，與正常對照組和奧美拉唑組比較，均有顯著性差異 (P＜0.05/0.01)。奧美拉唑含藥血清可引起食管下括約肌平滑肌細胞收縮，與正常對照組比較，有顯著性差異 (P＜0.01);但其對胃體、胃竇和胃幽門部位平滑肌細胞收縮無影響，與正常對照組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

表1 含藥血清對食管和胃不同部位平滑肌細胞收縮變化的影響 (±s，n=10)

表1 含藥血清對食管和胃不同部位平滑肌細胞收縮變化的影響 (±s，n=10)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與奧美拉唑組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 劑量/(g·kg－1)收縮變化指數(shù)正常對照組 － 67.54±6.52 － 85.75±7.92 － 85.18±8.17 － 82.57食管下括約肌 胃體 胃竇 幽門細胞長軸長度/μm收縮變化指數(shù)細胞長軸長度/μm收縮變化指數(shù)細胞長軸長度/μm收縮變化指數(shù)細胞長軸長度/μm±8.99 －奧美拉唑組 0.008 7 58.91±6.11＊＊ 12.78 82.03±8.69 4.34 80.59±8.54 5.39 80.88±9.30 2.05疏肝和胃顆粒組 10.8 52.75±3.88＊＊▲ 21.90 69.05±6.66＊＊▲▲ 19.48 70.78±8.40＊＊▲ 16.90 70.07±8.67＊＊▲15.14

2.2 對反流性食管炎大鼠食管病理組織學的影響 大體觀察可見，正常對照組和假手術(shù)組動物食管黏膜光滑完整，模型組大鼠食管黏膜均有呈點狀或條索狀等不同程度的發(fā)紅，甚或出現(xiàn)糜爛、潰瘍;奧美拉唑組、疏肝和胃顆粒組大鼠食管黏膜損傷程度介于上述二者之間。

光鏡下可見，正常對照組和假手術(shù)組動物食管組織基本無炎性改變，上皮細胞層內(nèi)間或存在少量炎細胞;模型組大鼠食管組織鱗狀上皮增生，細胞層次增加，以基底細胞增生為主，黏膜固有層可見數(shù)量不等的中性粒細胞及淋巴細胞浸潤;奧美拉唑組、疏肝和胃顆粒組食管組織炎性改變減輕，鏡下可見鱗狀上皮輕度增生，黏膜固有層可見少量的中性粒細胞及淋巴細胞。

電鏡觀察可見，正常對照組和假手術(shù)組動物可見正常食管黏膜上皮細胞，上皮細胞細胞器結(jié)構(gòu)、上皮細胞之間間隙正常，細胞之間可見多個橋粒連接，未見橋粒連接及數(shù)量異常;模型組可見細胞之間間隙增寬，橋粒連接結(jié)構(gòu)明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)細胞器腫脹;奧美拉唑組和疏肝和胃顆粒組上皮細胞及胞質(zhì)細胞器結(jié)構(gòu)、細胞之間橋粒連接和細胞間隙基本恢復正常。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠食管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化

2.3 對反流性食管炎大鼠血GAS、MTL和 VIP水平的影響 反流性食管炎大鼠模型血GAS水平下降，血MTL和VIP水平升高，與正常對照組比較，有顯著性差異 (P＜0.05/0.01)。對照藥物奧美拉唑可升高血GAS、MTL水平，降低血VIP水平，其中血GAS和VIP水平與模型組比較有顯著性差異 (P＜0.01);血MTL水平與正常對照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01)，但與模型組比較無顯著性差異(P＞0.0 5)，說明奧美拉唑不升高反流性食管炎大鼠血MTL水平。疏肝和胃顆?？缮哐狦AS、MTL水平，降低血VIP水平，其中血GAS和VIP水平與模型組比較有顯著性差異 (P＜0.01);血MTL水平與模型組和正常對照組比較均有顯著性差異 (P＜0.05/0.01)。結(jié)果見表2?！纒，n=10)

表2 對反流性食管炎大鼠血GAS、MTL和VIP水平的影響(

3 討論

反流性食管炎屬于祖國醫(yī)學“泛酸”、“反胃”、“噎膈”等范疇，胃失和降，胃氣上逆是本病的基本病機，肝胃郁熱，酸水泛溢為本病的發(fā)病關(guān)鍵，治療當以疏肝理氣、和胃降逆、清泄熱濁以治其本，制酸止痛以治其標。疏肝和胃顆粒方由柴胡、白芍、枳殼、姜半夏、陳皮、烏賊骨、黃芩、郁金、木香、生甘草十味藥組成，方中四逆散疏肝理脾，半夏、陳皮和胃降逆，黃芩配半夏辛開苦降，木香、郁金行氣活血，烏賊骨制酸斂瘍，共奏疏肝理脾、制酸行氣、和胃降逆之功。本實驗結(jié)果顯示疏肝和胃顆?？筛纳品戳餍允彻苎状笫笫彻莛つp傷，增加胃食管平滑肌細胞收縮力，調(diào)節(jié)血GAS、MTL和VIP水平。

反流性食管炎是酸相關(guān)性疾病，反流物進入食管，酸損傷引起食管黏膜炎癥，超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為上皮細胞間隙增寬，并與食管酸反流的程度相關(guān)［7-10］。本實驗結(jié)果顯示疏肝和胃顆?？梢愿纳颇Ｐ痛笫笫彻芙M織光鏡下鱗狀上皮增生、細胞層次增加及黏膜固有層中性粒細胞及淋巴細胞浸潤等組織學損傷，恢復電鏡下超微結(jié)構(gòu)食管上皮細胞間隙增寬、橋粒連接結(jié)構(gòu)減少及胞質(zhì)內(nèi)細胞器腫脹等組織學改變，上述改變與疏肝和胃降逆顆?？蓽p少食管反流物和食管酸損傷有關(guān)［11-12］。

反流性食管炎又是胃腸道動力相關(guān)性疾病。Biancani等［13］研究發(fā)現(xiàn)，長時間酸損傷可影響食管下括約肌的靜息壓力，從而減弱對酸性物質(zhì)的清除能力。本研究行半幽門結(jié)扎聯(lián)合賁門肌切開術(shù)復制反流性食管炎模型，引起大鼠食管胃內(nèi)容物反流和胃排空延遲，導致反流性食管炎的發(fā)生。疏肝和胃顆粒含藥血清孵育可引起食管下括約肌平滑肌細胞收縮增強，食管下括約肌的靜息壓升高，大鼠食管抗反流屏障功能改善，反流減少;同時，疏肝和胃顆粒含藥血清亦可引起胃體、胃竇和胃幽門部位平滑肌細胞收縮增強，增加胃蠕動和排空能力，降低腹壓，減少食管反流的發(fā)生。

反流性食管炎的發(fā)病機制與食管下括約肌功能異常密切相關(guān)，在反流性食管炎患者中表現(xiàn)為調(diào)節(jié)食管下括約肌張力和胃腸道運動的GAS、MTL和VIP等的異常。GAS是由胃竇及十二指腸黏膜開放型G細胞分泌，起到保護胃腸黏膜、增強胃腸黏膜保護因子和促進胃腸道的分泌功能，同時可提高幽門泵的活動，使幽門擴張，因而對胃排空有重要的促進作用［14］。MTL是由胃腸黏膜分泌的多肽，是公認的啟動胃腸收縮活動的腦腸肽，對胃腸道自主運動和平滑肌肌電活動有興奮作用，可提高胃腸道收縮力和張力，促進胃腸運動和胃排空，起著“清道夫”作用［15］。VIP為腸神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性肽能神經(jīng)遞質(zhì)，能引起食管下括約肌松弛，食管下括約肌壓力與血漿中VIP含量呈負相關(guān)，VIP神經(jīng)元增加或功能增強，可導食管下括約肌運動功能障礙。本實驗結(jié)果顯示，疏肝和胃顆?？缮叻戳餍允彻苎状笫笱狦AS、MTL水平，降低血VIP水平，促進胃腸平滑肌收縮，增加胃腸道的運動，這與本研究的離體實驗疏肝和胃顆粒血清孵育可引起胃體、胃竇和胃幽門部位平滑肌細胞收縮的研究結(jié)論一致。

本實驗結(jié)果中模型組大鼠血MTL水平與正常對照組比較未降低反而升高，可能與造模方法有關(guān)，研究采用半幽門結(jié)扎聯(lián)合賁門肌切開術(shù)復制反流性食管炎大鼠模型，手術(shù)造成大鼠食管反流和胃排空延遲，并非原發(fā)性胃腸動力下降引起反流性食管炎。另外，奧美拉唑含藥血清可引起食管下括約肌平滑肌細胞收縮，但對胃體、胃竇和胃幽門部位平滑肌細胞收縮基本無影響，其差異原因不明，尚待進一步研究。

上述實驗結(jié)果提示，疏肝和胃顆?？赏ㄟ^改善反流性食管炎食管黏膜損傷，增加食管、胃食管平滑肌細胞收縮力，調(diào)節(jié)GAS、MTL和VIP水平起到治療反流性食管炎作用。

［1］Wang J H，Luo J Y，Dong L，et al.Epidemiology of gastroesophageal reflux disease:a general population-based study in Xi＇an of Northwest China［J］.World J Gastroenterol，2004，10(11):1647-1651.

［2］李 上，趙健雄，祈永福.中醫(yī)藥治療胃食管反流病34例臨床觀察［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(9):2191-2192.

［3］祁永福，趙健雄，王學習，等.疏肝和胃降逆顆粒對反流性食管炎大鼠食管組織炎癥介質(zhì)表達的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36(19):2418-2422.

［4］徐 中，趙健雄，王學習，等.疏肝和胃降逆湯對反流性食管炎大鼠食管組織IL-23/IL-17軸的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，21(12):3200-3203.

［5］祁永福，趙健雄，王學習，等.舒肝和胃降逆顆粒對反流性食管炎大鼠食管FOXO4信號通路的影響［J］.廣東醫(yī)學，2010，31(20):2633-2636.

［6］Bitar K N，Makhlouf G M.Receptors on smooth muscle cells:characterization by contraction and specific antagonists［J］.Am J Physiol，1982，242(4):G400-407.

［7］張黎明，劉玉蘭，謝大赫，等.反流性食管炎及非糜爛性胃食管反流病超微結(jié)構(gòu)比較［J］.中華消化內(nèi)鏡雜志，2006，23(5):344-345.

［8］Tobey N A，Carson J L，Alkiek R A，et al.Dilated intercellular spaces:a morphological feature of acid reflux-damaged human esophagealepithelium［J］.Gastroenterology，1996，111(5):1200-1205.

［9］Caviglia R，Ribolsi M，Maggiano N，et al.Dilated intercellular spaces of esophageal epithelium in nonerosive reflux disease patients with physiological esophageal acid exposure［J］.Am J Gastroenterol，2005，100(3):543-548.

［10］Calabrese C，F(xiàn)abbri A，Bortolotti M，et al.Dilated intercellular spaces as a marker of oesophageal damage:comparative results in gastro-oesophageal reflux disease with or without bile reflux［J］.Aliment Pharmacol Ther，2003，18(5):525-32.

［11］Calabrese C，Bortolotti M，F(xiàn)abbri A，et al.Reversibility of GERD ultrastructural alterations and relief of symptoms after ome-prazoletreatment［J］.Am J Gastroenterol，2005，100(3):537-542.

［12］祁永福，趙健雄，王學習，等.疏肝和胃降逆顆粒對反流性食管炎大鼠食管黏膜增生的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(2):429-431.

［13］Biancani P，Barwick K，Selling J，et al.Effects of acute experimental esophagitis on mechanical properties of the lower esophageal sphincter［J］.Gastroenterology，1984，87(1):8-16.

［14］Rehfeld J F，F(xiàn)riis-Hansen L，Goetze J P，et al.The biology of cholecystokinin and gastrin peptides［J］.Curr Top Med Chem，2007，7(12):1154-1165.

［15］Xu L，Gao S，Guo F，et al.Effect of motilin on gastric distension sensitive neurons in arcuate nucleus and gastric motility in rat［J］.Neurogastroenterol Motil，2011，23(3):265-270.