高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定郁金中5種成分

王麗瑤， 王永祿， 陳琳琳

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036;2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210009)

郁金為臨床常用中藥，其基原復(fù)雜。2010年版《中國(guó)藥典》收載郁金為姜黃屬植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling、姜黃Curcuma longaL.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Ling或蓬莪術(shù)Curcuma phacocaulisVal.的干燥塊根，分別習(xí)稱為“溫郁金”、“黃絲郁金”、“桂郁金”或“綠絲郁金”［1］。郁金中的主要活性成分為姜黃素及倍半萜類成分［2］。其中姜黃素類成分主要有姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素等;倍半萜類成分主要有芳姜黃酮、bisacurone等［3-5］。不同基原郁金藥材的化學(xué)成分有所不同，質(zhì)量差異較大［6-7］。目前， 《中國(guó)藥典》2010年版尚無(wú)郁金的定量測(cè)定內(nèi)容，文獻(xiàn)中多見(jiàn)對(duì)某種郁金揮發(fā)油類成分的GC-MS分析或?qū)S素的定量測(cè)定［8-12］。因此，有必要建立簡(jiǎn)單可行的分析方法對(duì)不同基原郁金的姜黃素及倍半萜類成分進(jìn)行綜合分析，以期為郁金的質(zhì)量控制、臨床用藥的安全有效提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agillent 1200型高效液相色譜儀 (二極管陣列檢測(cè)器、四元泵、柱溫箱、化學(xué)工作站);Diamonsil C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。對(duì)照品姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮為實(shí)驗(yàn)室自制，采用HPLC峰面積歸一化法測(cè)定，純度均大于98%。乙腈 (色譜純，Merck公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。從不同產(chǎn)地收集郁金藥材共9件，經(jīng)王麗瑤鑒定，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥資源教研室陳琳琳教授復(fù)核，9件郁金藥材分別為溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling、姜黃Curcuma longaL.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Ling、蓬莪術(shù)Curcuma phacocaulisVal.的塊根，即分別為溫郁金、黃絲郁金、桂郁金及綠絲郁金。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)5種成分進(jìn)行掃描，3種姜黃素類化合物的最大吸收波長(zhǎng)分別為姜黃素426 nm、去甲氧基姜黃素423 nm、雙去甲氧基姜黃素417 nm;倍半萜類化合物的最大吸收波長(zhǎng)分別為bisacurone B 242 nm、芳姜黃酮240 nm。為兼顧各組分的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度，最終選取420 nm作為姜黃素類化合物的檢測(cè)波長(zhǎng);240 nm作為倍半萜類化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈－0.6%冰乙酸溶液梯度洗脫 (0～10 min，27%乙腈;10～14 min，27% ～50%乙腈;14～24 min，50%乙腈;24～36 min，50%～90%乙腈);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm、420 nm。在此色譜條件下，3種姜黃素類成分及2種倍半萜類成分分離良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液 (A)和供試品溶液 (B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixture referencesolution(A)and sample solution(B)

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取對(duì)照品姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮適量，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含上述對(duì)照品 0.210 2、0.095 6、0.090 7、0.125 8、0.269 9 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取郁金藥材細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓回收甲醇，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將2.3.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品貯備液由高至低逐級(jí)稀釋制得系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別記錄姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3種姜黃素類成分及2種倍半萜類成分的回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種姜黃素類成分及2種倍半萜類成分的回歸方程和線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges for the three curcuminoids and two sesquiterpenes

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積RSD分別為1.24%、1.12%、1.07%、0.93%、0.86%，精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取郁金樣品約1.0 g，精密稱定，共取6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積積分值，計(jì)算，結(jié)果上述5種成分的RSD分別為1.67%、1.46%、1.25%、1.36%、1.97%，重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別在0、2、4、6、8、12 h按2.2項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積積分值，結(jié)果上述5種成分的RSD分別為 2.03%、1.86%、1.92%、1.03%、0.96%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 最低檢測(cè)限 取混合對(duì)照品溶液逐步稀釋后，注入高效液相色譜儀，以峰高為基線噪音3倍計(jì)，測(cè)得姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的最低檢測(cè)限分別為0.105 075、0.095 6、0.090 7、0.062 9、0.134 95 μg/mL。

2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含有量的郁金樣品約0.5 g，精密稱定，共取9份，分3組，每組3份，每組按樣品中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮各自含有量的80%、100%、120% 分別精密加入對(duì)照品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果上述5種成分的平均加樣回收率分別為 97.05%、97.35%、98.76%、101.28%、97.27%，RSD分別為1.79%、1.06%、0.95%、1.38%、1.85%，方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 樣品測(cè)定 取郁金樣品約1.0 g，精密稱定，按2.3.2項(xiàng)下方法每個(gè)樣品平行制備供試品溶液2份，分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、bisacurone B、芳姜黃酮的峰面積積分值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 郁金中5種成分的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of determination of five compounds in Curcumae Radix

3 討論

3.1 供試品制備條件的優(yōu)化 在供試品溶液制備過(guò)程中，分別對(duì)提取方式 (回流、超聲)、提取溶劑 (甲醇、乙醇、乙酸乙酯)及用量、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明用50 mL甲醇加熱回流提取0.5 h為最佳提取條件。

3.2 流動(dòng)相的選擇 分別采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.6%冰乙酸、乙腈-0.1%磷酸等系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，如果流動(dòng)相中不加酸，姜黃素類化合物的峰形較差。乙腈-0.6%冰乙酸系統(tǒng)的條件為最佳，冰乙酸對(duì)色譜峰峰形的改善具有較好的效果，且基線穩(wěn)定，分析周期短，得到了滿意的分析結(jié)果。

3.3 不同基原郁金藥材測(cè)定結(jié)果分析 對(duì)不同基原郁金藥材測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃絲郁金藥材中各指標(biāo)成分的量均較高，其它3種郁金藥材中各指標(biāo)成分量均較低。結(jié)合已有研究結(jié)果［6］，認(rèn)為不同種姜黃屬植物的塊根均作為郁金藥用質(zhì)量相差甚大，難以保證臨床用藥的安全有效，有必要對(duì)藥材質(zhì)量做進(jìn)一步的規(guī)范;同時(shí)建議種植高品質(zhì)的郁金品種。

3.4 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定郁金藥材中3種姜黃素類成分和2種倍半萜類成分;測(cè)定了9批4種不同基原的郁金藥材，反映了不同基原郁金藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，能夠?yàn)橛艚鹚幉牡馁|(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的參考。

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