間接ELISA法測定刺五加注射液中的過敏性雜質

于風平， 胡昌勤

(1.淄博市藥品檢驗所，山東淄博 255086;2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

刺五加Acanthopanax senticosus(Ruper.Et Maxim.)harms為五加科五加屬植物刺五加的干燥根和根莖及莖，含有刺五加苷、香豆素、刺五加酮、微量元素等多種藥理活性成分［1］，有益氣健脾、補腎安神的功效，主治脾腎陽虛，體虛乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多夢［2］。刺五加注射液由刺五加藥材經“水提醇沉”工藝［3－4］制備而成，臨床上大量應用于治療心腦血管疾病、心臟疾病、肺臟疾病、植物神經功能紊亂等疾?。?］。近年來有關刺五加注射液不良反應 (ADR)的報道正逐年增多，其中過敏反應是刺五加注射液的主要不良反應［6］，其發(fā)生速度快、危害大;發(fā)生率與性別、劑量無顯著性差異［7］。國家藥品ADR檢測中心收到有關刺五加注射液嚴重ADR報告和死亡病例較多，有研究表明殘留在刺五加注射液中的植物蛋白等過敏性雜質，可能是造成其臨床上過敏反應時常發(fā)生的主要原因［8］。本實驗模擬刺五加注射液生產工藝，從刺五加藥材中提取了刺五加抗原，并制備了特異性抗體，建立了間接ELISA法，經過方法學的深入研究，證明該方法可以用于檢測刺五加注射液中的過敏性雜質，這對探討含刺五加藥材的中藥注射劑不良反應具有重要意義。

1 材料

1.1 試劑與藥品 胎牛血清、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化氫尿素、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均來自Sigma公司;蛋白標準品、Bradford蛋白試劑盒、透析袋來自Bio-RAD公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(蛋白質量濃度為400 μg/mL)來自 Santa Cruz Biotechnoligy公司;96孔酶標板購自天津天宇有機玻璃制品高分子技術有限公司;刺五加藥材由中國食品藥品檢定研究院提供;刺五加注射液共計6個廠家，92批樣品，為2006年全國監(jiān)督抽驗樣品。

1.2 主要儀器 酶標儀 (Multiskan Spectrum)為Thermo公司產品;離心機 (AvantiTM30 Centrifuge)為Backman公司產品;洗板機 (Model 1575)為Bio-RAD公司產品;真空干燥箱 (VDL115)為Binder公司產品。

1.3 實驗動物 新西蘭大白兔，4～5個月齡，體質量2～3 kg，由中國食品藥品檢定研究院動物繁育場提供。

2 刺五加抗原及兔抗刺五加抗原抗體的制備

2.1 刺五加抗原的制備 取干燥的刺五加藥材粉碎，稱取粉末51.7 g置500 mL蒸餾瓶中，加水250 mL加熱回流提取2 h，過濾，濾渣加水150 mL繼續(xù)加熱回流1.5 h，過濾，合并2次的濾液，加熱濃縮至約80 mL，再次過濾，濾液加入等體積冰冷的無水乙醇，于4℃冷藏12 h，4℃條件下5 000×g離心20 min，棄去上清液，沉淀常溫減壓干燥，得到粉末0.31 g，作為刺五加抗原。

2.2 兔抗刺五加抗原抗體的制備 取刺五加抗原加水溶解并稀釋成10 mg/mL的溶液，分別與等體積的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑充分乳化，制成免疫抗原1和免疫抗原2;新購買的家兔飼養(yǎng)1周后，參照文獻［9］的免疫方法，先用免疫抗原1進行基礎免疫，每周1次，連續(xù)2周;再用免疫抗原2進行加強免疫，每周1次。每次加強免疫5 d后，從耳動脈取血少許，按照間接ELISA法測試抗血清效價，第3次加強免疫后，抗血清效價達到1∶6 400，采取剝離頸動脈的方式取血并分離血清［9-10］。

取兔血清2 mL，加飽和的硫酸銨溶液2 mL，4℃靜置2 h，9 000×g離心10 min，沉淀溶于2 mL水中，加飽和的硫酸銨溶液2 mL，4℃再靜置2 h，9 000×g離心10 min，沉淀復溶于2 mL的PBS(0.01 mol/L，pH7.4)溶液中，裝入透析袋，4℃對200 mL的上述PBS溶液透析12 h，每隔3 h更換1次透析液［9-11］。純化后的抗體用上述PBS溶液定容至3 mL，作為兔抗刺五加抗原抗體?？贵w采用Brandford法［12］測定總蛋白量為5.35 mg/mL。

3 間接ELISA法的建立

3.1 間接ELISA法試驗步驟［9］第1步，包被刺五加抗原溶液，每孔100 μL，4℃放置20 h，反復洗滌6次。第2步，用5%小牛血清溶液封閉，每孔275 μL，37℃反應1 h，反復洗滌6次。第3步，加兔抗刺五加抗原抗體，每孔100 μL，37℃反應1 h，反復洗滌6次。第4步，加0.4 μg/mL的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG溶液，每孔100 μL，37℃反應1 h，反復洗滌9次。第5步，加TMB-H2O2尿素底物緩沖液，每孔100 μL，37℃暗處反應約15 min。第6步，每孔加終止液50 μL。第7步，用酶標儀記錄450 nm的吸光度讀數(shù)。

3.2 方陣滴定 刺五加抗原用包被液稀釋成256 μg/mL的溶液，作為起始質量濃度，倍比稀釋，分別包被在酶標板上，同時包被陰性 (包被液)和陽性 (兔抗刺五加抗原抗體)對照;兔抗刺五加抗原抗體，質量濃度分別為 1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 μg/mL，按照3.1項間接 ELISA法試驗步驟作方陣滴定。最終選擇了最佳的抗體工作質量濃度為0.8 μg/mL，最佳的刺五加抗原質量濃度范圍為 4 ～128 μg/mL。

3.3 抗原包被時間 按照3.1項間接ELISA法試驗步驟，考察質量濃度為128 μg/mL的刺五加抗原，包被時間分別為 11、12、14、16、18、20、22、24 h，其在酶標板上的結合情況。以吸光度值為縱坐標，包被時間為橫坐標做折線圖 (見圖1)，從圖中可以看到:隨著包被時間的增加，同一質量濃度的刺五加抗原的吸光度值也相應的增加，當包被時間達到20 h時，包被時間再增加，刺五加抗原的吸光度值變化不大，可認為其已經較為完全的結合到96孔酶標板上了。因此，當刺五加抗原質量濃度為128 μg/mL時，包被時間至少要20 h。

圖1 抗原吸光度值與包被時間的關系Fig.1 Relationship of absorbance and time

3.4包被液的選擇 取刺五加抗原，分別用水、pH7.4的PBS溶液和pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成128 μg/mL的溶液，包被在酶標板上，按照3.1項間接ELISA法試驗步驟進行試驗，考察不同包被液對試驗結果的影響。結果包被液對試驗結果影響很大，以pH9.6碳酸鹽緩沖液作為包被液效果最好。

3.5 封閉液及封閉時間的選擇 主要考察了5%脫脂奶粉和5%小牛血清分別封閉1 h、1.5 h的封閉效果。確定采用5%小牛血清封閉1 h。

3.6 標準曲線 取包被液稀釋的刺五加抗原溶液(128 μg/mL)，用包被液倍比稀釋，分別包被在96孔酶標板上，按照3.1項間接ELISA法試驗步驟進行試驗。以抗原質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標做線性回歸，得回歸曲線為Y=0.007 9X+0.08(R2=0.999)，抗原質量濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關系;本方法刺五加抗原質量濃度的線性范圍為4 ～128 μg/mL。

3.7 檢出限與定量限 根據(jù)AOAC的標準，以陰性均值 (X)加3倍標準差 (SD，n=20)的和(X+3SD)作為本方法的檢出限，以陰性均值(X)加10倍標準差 (SD，n=20)的和 (X+10SD)作為本方法的定量限，確定本方法的檢出限約為 0.5 μg/mL，定量限約為 4 μg/mL。

3.8 精密度實驗 取低 (8 μg/mL)、中 (32 μg/mL)、高 (100 μg/mL)3個質量濃度的刺五加抗原溶液包被在同一酶標板上，各包被10孔，按照3.1項間接ELISA法試驗步驟進行試驗。低(8 μg/mL)、中 (32 μg/mL)、高 (100 μg/mL)3個質量濃度的刺五加抗原溶液在同一酶標板上的吸光度精密度分別為8.8%、6.9%、3.2% (n=10)。結果表明本方法的精密度較好。

3.9 樣品前處理 本實驗采取了下列方式調節(jié)刺五加注射液的pH值和離子濃度:取樣品90 μL加入10倍濃度的包被液10 μL，對樣品的pH值和離子強度進行調節(jié)，調節(jié)后的樣品pH值在9.6左右，與包被液的pH值接近。調節(jié)后的樣品按照3.1項間接ELISA法試驗步驟進行試驗。

3.10 加樣回收率試驗 將刺五加抗原加入到已知抗原質量濃度的刺五加注射液 (抗原質量濃度為4.8 μg/mL)中，使其刺五加抗原的加入量分別為4、16、32、100 μg/mL，按照3.9項樣品前處理和3.1項間接ELISA法試驗步驟進行試驗，根據(jù)試驗結果計算平均加樣回收率。本方法的低、中、較高、高4個質量濃度的加樣回收率分別為79.9%、87.7%、91.2%、96.3%，平均加樣回收率為88.8%，RSD為7.3%。見表1。

表1 加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of the recovery tests

3.11 特異性 取不含刺五加藥材的丹參注射液、香丹注射液、魚腥草注射液、穿心蓮注射液、醒腦靜注射液、香丹冠心注射液各3批按照3.9項樣品前處理和3.1項間接ELISA法試驗步驟進行試驗，結果均未檢出過敏性雜質。表明本實驗所制備的兔抗刺五加抗原抗體特異性與刺五加抗原相結合，而與其他種類抗原不發(fā)生相互作用，本實驗方法特異性的檢測來自刺五加藥材的過敏性物質。

3.12 樣品測定 對來自于6個廠家的92批樣品進行了檢測，共有8批 (8.7%)樣品檢出過敏性雜質，其過敏性雜質的量在0.5～10 μg/mL。

4 討論

4.1 間接ELISA試驗結果顯示 92批刺五加注射液中，8批呈陽性，這8批樣品較為分散的分布在5個藥品生產企業(yè)的樣品中，提示刺五加注射液的生產工藝不完善具有普遍性。根據(jù)國家ADR監(jiān)測中心的數(shù)據(jù) (截至2007年10月31日)顯示，刺五加注射液的ADR(主要為過敏反應)報告涉及的藥品生產企業(yè)40余家，而這5個企業(yè)產品的ADR報告量占前五位，總比例達到了94.5%。從刺五加注射液的市場抽驗結果發(fā)現(xiàn)，這5個企業(yè)的產品約占本次抽驗數(shù)量的97.8%(按批計算)，推斷在臨床使用上，這5個企業(yè)的產品占據(jù)絕大數(shù)，因此認為刺五加注射液ADR的發(fā)生率可能與其臨床用藥的數(shù)量有一定的關系。

表2 樣品數(shù)量、陽性率與ADR發(fā)生率Tab.2 Quantity of sample，positive sample and ADR

4.2 本實驗中間接ELISA法各試驗步驟中的反應時間、洗滌次數(shù)、溫度，都是經過多次反復實驗的最終選擇。若洗滌次數(shù)不夠，就造成試驗的陰性值增高，方法的靈敏度下降;若包被時間低于20 h，刺五加抗原不能完全結合到酶標板上，抗原質量濃度與吸光度值就不能呈現(xiàn)一次線性關系，可出現(xiàn)拋物線關系，但方法的精密度和準確度就會降低;該方法的各試驗步驟需要采用固定的溫育溫度、反應時間，才能保證實驗的可重復性。

4.3 在加樣回收率試驗中發(fā)現(xiàn)，當加入低質量濃度的刺五加抗原溶液時，平均加樣回收率較低，主要是由于抗原濃度太低，位于線性范圍的下限，測定結果的準確性較低所致;當加入高質量濃度的刺五加抗原溶液時，平均加樣回收率高達96.3%。另一方面，中藥注射液中的成分復雜，樣品中的某些物質可能干擾測定，也會導致加樣回收率低。在精密度試驗中發(fā)現(xiàn)，同一樣品在同一塊酶標板上多次測定，其精密度良好;但同一樣品在不同的酶標板上多次測定，其吸光度差別較大，只有采用每一塊酶標板都做一條標準曲線進行校正后，測定結果的精密度方可達到試驗要求。

4.4 本實驗建立的間接ELISA法對于刺五加注射液中的痕量過敏性雜質檢測具有重要的臨床指導意義，該方法具有較高的精密度、較好的加樣回收率、高靈敏度、特異性強等優(yōu)點，可以用于刺五加注射液中過敏性雜質的定性和定量分析。

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