RP-HPLC法同時測定淫桂通便顆粒中6種成分

王 蕾， 談瑄忠， 毛春芹， 陸兔林， 王會娟， 胡穎菲

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046;2.南京市中醫(yī)院，江蘇南京 210001)

淫桂通便顆粒由肉桂、淫羊藿、厚樸、葛根、薤白、茯苓共六味飲片組成，具有溫補(bǔ)脾腎、潤腸通便之功效，用于治療脾腎陽虛型便秘。本方為南京市中醫(yī)院院內(nèi)經(jīng)驗(yàn)方，已在臨床使用多年，對脾腎陽虛便秘具有治療作用，且能溫陽活血標(biāo)本兼治。肉桂、淫羊藿是方中重要藥物，肉桂具有補(bǔ)火助陽，引火歸源，散寒止痛等作用，其有效成分為肉桂醛［1－2］;淫羊藿有補(bǔ)腎陽的作用，其有效成分是淫羊藿苷［3－5］。目前采用薄層鑒別法對其中幾味藥進(jìn)行了質(zhì)量控制，而且現(xiàn)行采用HPLC法對制劑的質(zhì)量控制大多只測一種成分，不能全面反應(yīng)控制復(fù)方質(zhì)量［6－7］，為了更好控制本品質(zhì)量，本研究采用HPLC法同時定量測定方中葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚與厚樸酚，效果理想，達(dá)到了全面控制該制劑質(zhì)量的目的，可為臨床安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100型高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司，包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測器);Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(淮陰漢邦科技有限公司);紫外分析儀WD-9403C型 (北京市六一儀器廠);水浴鍋 (鞏義市英峪予華儀器廠);FA1104型萬分之一電子分析天平 (上海天平儀器廠);KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器 (昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 葛根素對照品(批號110752-200511)、淫羊藿苷對照品 (批號 110737-200312)、肉桂酸對照品 (批號110786-200503)、肉桂醛對照品 (批號110795-201007)、和厚樸酚(批號 110730-201011)、厚樸酚 (批號 110729-200411)均由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，甲醇、磷酸為分析純。淫桂通便顆粒為醫(yī)院自制 (批號為120322、120325、120329，規(guī)格為:10g/袋)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫35℃;流動相為乙腈 －0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測波長290 nm。對照品色譜圖、樣品色譜圖及陰性樣品色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫時間順序Tab.1 Mobile phase in gradient elution mode

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合對照品貯備液的制備 分別精密稱取葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為每1 mL含葛根素0.039 0 mg、淫羊藿苷0.217 5 mg、肉桂酸0.184 2 mg、肉桂醛0.012 5 mg、和厚樸酚0.556 9 mg以及厚樸酚0.446 2 mg的對照品貯備溶液。精密量取上述對照品溶液適量置5 mL量瓶中，甲醇定容，混勻，制成每1 mL含葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚分別為 7.8、43.5、36.84、2.5、55.69、44.62 μg 的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷至室溫，以甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別稱取除葛根、淫羊藿、肉桂、厚樸以外的其余藥味，按照淫桂通便顆粒的制備工藝，制備不含葛根、淫羊藿、肉桂、厚樸的陰性樣品。按2.3項(xiàng)下方法制成缺葛根、淫羊藿、肉桂、厚樸的陰性對照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品1 mL，稀釋1倍，分別進(jìn)樣4、6、8、10、20 μL，測定峰面積。以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為:葛根素Y=57.66X+4.591 2，r=0.999 9;淫羊藿苷Y=11.797X－4.503 1，r=0.999 6;肉桂酸Y=71.527X－24.91，r=0.999 7;肉桂醛Y=2 701.2X－40.667，r=0.999 8;和厚樸酚Y=19.014X－5.793 7，r=0.999 7;厚樸酚Y=22.207X+3.905 2，r=0.999 7。結(jié)果表明，葛根素在1.56～7.80 μg、淫羊藿苷在8.70～43.50 μg、肉桂酸在7.37～36.84 μg、肉桂醛在 0.5～2.5 μg、和厚樸酚 8.92～44.62 μg、厚樸酚在11.14 ～55.69 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各峰面積，并計(jì)算各RSD值。結(jié)果葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚峰面積RSD分別為0.79%、0.97%、1.24%、0.01%、0.01%、1.21%，表明儀器精密度良好，符合定量測定要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液，于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果表明所測6種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚峰面積的 RSD分別為 2.60%、0.41%、2.89%、2.12%、2.91%、2.64%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品，按2.3項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜進(jìn)樣分析，葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.548 3、0.622 4、0.414 7、0.023 7、0.238 2、0.534 3 mg/g;RSD 分別為2.94%、1.83%、2.85%、2.54%、2.26%、1.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別精密稱取6種對照品適量，置同一量瓶中，配置成分別含葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚0.242 0、0.339 8、0.275 3、0.010 1、0.213 0、0.220 3 mg/mL的混合對照品溶液，備用。精密稱取已測定的樣品9份，每份約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入混合對照品溶液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣記錄色譜峰，計(jì)算各回收率。結(jié)果葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚樸酚及厚樸酚的平均加樣回收率依次為 97.20%、98.78%、97.48%、97.39%、98.81%、98.40%，RSD分別為2.15%、0.79%、1.71%、1.47%、0.82%、0.91%。

2.10 樣品測定 取各批淫桂通便顆粒樣品(120322、120325、120329)，精密稱取約2 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，根據(jù)外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中6種成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 3批淫桂通便顆粒樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination results of the three batches of samples in Yingui Tongbian Granules(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 對檢測波長選擇時，由于淫桂通便顆粒成分復(fù)雜，其主要有效成分的紫外吸收差異很大，試驗(yàn)中對混合對照品進(jìn)行吸收光譜掃描，結(jié)果表明在260 nm以下淫羊藿苷、肉桂醛等被測靈敏度大大降低，和厚樸酚、厚樸酚基本檢測不出;在290 nm處有被測各種成分均能出峰，為了使各組分在同一波長下都能有較好吸收，達(dá)到吸收強(qiáng)、干擾小的目的，故選擇290 nm作為檢測波長。

3.2 提取方法的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8-9］，本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑甲醇和乙醇，結(jié)果表明甲醇提取率比乙醇提取率高，甲醇提取的供試品進(jìn)入液相雜質(zhì)干擾少，所以選擇甲醇作為提取溶劑;同時考察了提取方式［10］(冷浸提取、超聲提取和回流提取)、提取時間 (20、30、40 min)對提取結(jié)果的影響，結(jié)果表明超聲提取與回流提取對提取率沒有顯著差異;超聲提取20、30、40 min對提取率沒有顯著差異。綜合考慮提取時間、成本、提取率，選擇甲醇超聲提取20 min。

3.3 流動相的選擇 參考文獻(xiàn)［11-12］比較了多種流動相系統(tǒng)，包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液，結(jié)果表明采用乙腈-磷酸水溶液，基線平穩(wěn)，大多數(shù)化合物具有更高的靈敏度，且肉桂酸的峰型較好，各峰均沒有拖尾，各峰間的分離度均達(dá)到1.5以上，故選擇流動相為乙腈－0.1%磷酸水梯度洗脫。

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