促進(jìn)劑對風(fēng)濕痹痛方中新烏頭堿體外經(jīng)皮吸收的影響

荊蘊杰， 張文品

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧沈陽 110101)

風(fēng)濕痹痛藥方由草烏、徐長卿、紅花、當(dāng)歸、三七等六味中藥材組成，為我院治療風(fēng)寒濕所致諸痛的協(xié)定處方。具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)通絡(luò)、活血通絡(luò)、散寒止痛之功。臨床上采用藥材粉碎，調(diào)糊外敷治療風(fēng)濕類關(guān)節(jié)病所致之疼痛已有近10年歷史，病例數(shù)達(dá)上千例，臨床療效確切，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。目前促進(jìn)藥物透皮吸收的方法，最常用的藥劑學(xué)方法就是使用透皮吸收促進(jìn)劑，具有對皮膚作用短暫可逆、刺激性低等優(yōu)點，為使本方更好的發(fā)揮療效，本研究通過體外透皮實驗篩選出透皮促進(jìn)劑及其比例和濃度。藥方中的草烏具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛之功效為君藥，其所含的生物堿類物質(zhì)，具有明顯的鎮(zhèn)痛［1］、抗炎［2］作用。因此，本研究選用其中的新烏頭堿的累積透過量作為經(jīng)皮給藥的評價指標(biāo)，考察透皮促進(jìn)劑及其組合的透皮促進(jìn)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 改良Franz擴散池 (自制)，Anke TGL-16GC高速臺式冷凍離心機 (上海安亭科學(xué)儀器總廠)，磁力攪拌器 (江蘇中正儀器廠)，日立L—7100高效液相色譜儀、日立L-7420紫外檢測器、數(shù)據(jù)采集軟件天美色譜工作站。

1.2 材料 新烏頭堿對照品 (批號110799-200404)(中國食品藥品檢定研究院)，乙腈、甲醇為色譜純，1，2丙二醇薄荷醇、氮酮等其他試劑均為分析純。風(fēng)濕痹痛方藥材由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥劑科提供。Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證SCXK(軍)2007-004。

2 方法

2.1 體外透皮分析方法的建立

2.1.1 檢測波長的確定 稱取適量新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，制備成約10 μg/mL溶液。按紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版附錄VA)，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描其吸收光譜。紫外掃描結(jié)果顯示，新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品在235 nm處有最大吸收，因此確定本實驗中采用235 nm作為檢測波長。

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS C18柱 (250 mm×416 mm，5 μm);檢測波長235 nm;流動相為乙腈-醋酸銨緩沖溶液 (pH 10.5)(65∶40);體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;柱溫40℃。

2.1.3 新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取新烏頭堿對照品5.0 mg，用甲醇配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的貯備液。精密移取上述貯備液至10 mL量瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 μg/mL的系列新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度對相應(yīng)的峰面積作回歸計算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=6.0×10－7A－4.4×10－3，r=0.999 2。結(jié)果表明新烏頭堿質(zhì)量濃度在0.025～0.5 μg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 促進(jìn)劑對風(fēng)濕痹痛藥方中新烏頭堿體外經(jīng)皮吸收影響考察［3-8］

2.2.1 實驗樣品的制備 將風(fēng)濕痹痛藥方藥材粉碎過6號篩備用。依處方量稱取各味藥粉，按等量遞增混勻，以1∶2比例加入蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蛑苽涑苫鞈乙骸?/p>

2.2.2 離體大鼠皮膚的制備 將雄性Wistar大鼠 (180～220 g)，用20%的烏拉坦腹腔注射，大鼠達(dá)到麻醉狀態(tài)，將腹部毛剃凈后，處死。立即用手術(shù)剪刀分離腹部皮膚，用眼科手術(shù)小剪刀仔細(xì)剝離皮下脂肪及結(jié)締組織，用生理鹽水漂洗干凈，放入低溫冰箱中保存，7 d內(nèi)使用，實驗前檢查鼠皮，不得有任何損傷。

2.2.3 透皮擴散實驗方法 用改進(jìn)的Franz擴散池進(jìn)行實驗。將處理好的鼠皮固定于擴散池接口處，角質(zhì)層面向供給池，上下夾緊后，接受池中用注射器通過取樣管將接受液 (pH 7.4磷酸鹽緩沖液)注滿，向供給池中加入4 g供試品，排凈空氣，使之與接受液間無氣泡。水浴溫度(32.0±0.5)℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣，每次吸取接收液3 mL，并補加等量接受液，樣品于16 000 r/min低溫離心機離心5 min后，按2.1.2項下條件測定新烏頭堿的量。

2.2.4 數(shù)據(jù)計算方法 取出的接收液按2.1.2項、2.1.3項方法測定新烏頭堿，并用下面公式計算藥物累積透過量:

2.2.5 考察單一滲透促進(jìn)劑對新烏頭堿的影響 分別稱取20 g的混懸液，加入不同種類及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的促滲劑(1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、3%薄荷醇、5%薄荷醇、10%薄荷醇、5%油酸、5%吐溫-80)混勻，作為供試品，考察對新烏頭堿透皮吸收的影響。

2.2.6 考察合用滲透促進(jìn)劑對新烏頭堿的影響 在確定最佳單一透皮促滲劑后，選用1%、3%和5%的丙二醇與之合用作為供試品，考察對新烏頭堿透皮吸收的影響。

3 結(jié)果

3.1 單用滲透促進(jìn)劑對風(fēng)濕痹痛藥方中新烏頭堿頭皮吸收的影響 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本雙側(cè)t檢驗，與空白對照組相比，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%的氮酮，3%、5%、10%的薄荷醇，5%的吐溫-80，新烏頭堿的累積透過量和穩(wěn)態(tài)滲透速率有不同程度的增加。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的薄荷醇后新烏頭堿的累積透過量顯著地增加 (P＜0.05)，加3%的氮酮、5%的薄荷醇后穩(wěn)態(tài)通透速率顯著性增加 (P＜0.05)。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%氮酮、10%薄荷醇、5%油酸顯著縮短了時滯 (P＜0.05)，3%的氮酮極顯著縮短了時滯(P＜0.01)，其他促進(jìn)劑對時滯無顯著性影響 (P＞0.05)。而加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的油酸、1%的氮酮后，新烏頭堿的累積透過量及穩(wěn)態(tài)通透速率不但沒有增加，反而降低了，說明5%的油酸、1%的氮酮對新烏頭堿的透皮吸收具有抑制作用，5%的油酸穩(wěn)態(tài)通透速率顯著性抑制 (P＜0.05)。結(jié)果見表1，滲透曲線見圖1。

表1 單一促進(jìn)劑作用下新烏頭堿的經(jīng)皮吸收參數(shù) (n=3，±s)

表1 單一促進(jìn)劑作用下新烏頭堿的經(jīng)皮吸收參數(shù) (n=3，±s)

注:Js為穩(wěn)態(tài)滲透速率，ER為增滲倍數(shù)，tlag為時滯，Q12為12 h單位面積累積透過量。*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

促進(jìn)劑Js/ER空白(μg·h－1·cm －2)Q12/(μg·cm －2)tlag/h 0.41±0.04 4.24±0.60 2.15±0.21 1.00 1%氮酮 0.31±0.03 3.51±0.82 0.58±0.20* 0.76 3%氮酮 0.64±0.03* 7.46±0.84 0.01±0.12＊＊ 1.56 5%氮酮 0.58±0.10 6.76± 0.89 1.44±0.26 1.41 3%薄荷醇 0.68±0.04 7.95±0.42* 0.61±0.35 1.66 5%薄荷醇 0.59±0.04* 6.70±0.04 1.00±0.08 1.44 10%薄荷醇 0.67±0.07 7.70±0.81 0.67±0.09* 1.63 5%油酸 0.25±0.02 2.75±0.24 1.12±0.16* 0.61 5%吐溫-80 0.42±0.04 4.52±0.44 1.57±0.41 1.02

圖1 單一促進(jìn)劑作用下新烏頭堿的滲透曲線

3.2 合用促進(jìn)劑對風(fēng)濕痹痛藥方中新烏頭堿頭皮吸收的影響 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本雙側(cè)t檢驗，與空白對照組相比，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%丙二醇+3%薄荷醇、3%丙二醇和3%薄荷醇、5%丙二醇+3%薄荷醇后新烏頭堿的累積透過量均顯著地增加 (P＜0.05)，加入1%丙二醇+3%薄荷醇、5%丙二醇+3%薄荷醇后新烏頭堿的穩(wěn)態(tài)通透速率顯著性增加 (P＜0.05)，加入3%丙二醇+3%薄荷醇后新烏頭堿的穩(wěn)態(tài)通透速率極顯著性增加 (P＜0.01)，加入均為3%丙二醇+薄荷醇后極顯著縮短了時滯 (P＜0.01)，而加入1%丙二醇+3%薄荷醇、5%丙二醇+3%薄荷醇對縮短時滯無顯著性影響 (P＞0.05)。結(jié)果見表2，滲透曲線見圖2。

表2 合用促進(jìn)劑作用下新烏頭總堿透皮吸收參數(shù) (n=3，±s)

表2 合用促進(jìn)劑作用下新烏頭總堿透皮吸收參數(shù) (n=3，±s)

注:Js為穩(wěn)態(tài)滲透速率，ER為增滲倍數(shù)，tlag為時滯，Q12為12 h藥物單位面積累積透過量。*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

促進(jìn)劑J s/E R空白(μ g·h－1·c m －2)Q 1 2/(μ g·c m －2)t lag/h 0.4 1±0.0 4 4.2 4±0.6 0 2.1 5±0.2 1 1.0 0 3%薄荷醇+1% 丙二醇 0.8 1±0.0 5* 8.8 0±0.6 1* 1.4 1±0.0 8 1.9 8 3%薄荷醇+3%丙二醇 1.3 6±0.1 6＊＊ 1 5.4 7±1.8 2* 0.4 3±0.1 9＊＊ 3.3 2 3%薄荷醇+5% 丙二醇 0.9 4±0.0 6* 1 1.0 4±1.0 9*1.5 2±0.0 6 2.2 9

圖2 合用滲透促進(jìn)劑作用下新烏頭堿的滲透曲線

4 討論

草烏是風(fēng)濕痹痛方中的君藥，發(fā)揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)試驗表明具有鎮(zhèn)痛、抗炎、局部麻醉、抗腫瘤等作用，其中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿是其有效成分［2］，因此選擇了新烏頭堿作為指標(biāo)化合物，進(jìn)行中藥復(fù)方體外透皮實驗，考察幾種常用滲透促進(jìn)劑對新烏頭堿的經(jīng)皮滲透性影響，在一定程度上可以反映體內(nèi)給藥的效果。

皮膚作為防止外界物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)和體內(nèi)水分散失的天然屏障，由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，其中表皮又可分為角質(zhì)層和活性表皮，角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮吸收的主要屏障和限速部位。在增加藥物經(jīng)皮通透的方法中，使用經(jīng)皮吸收促進(jìn)劑能夠增加藥物的經(jīng)皮滲透能力，減少時滯，提高藥物生物利用度［9］。文獻(xiàn)曾報道通過電子自旋共振光譜發(fā)現(xiàn)，薄荷醇可使角質(zhì)層剛性結(jié)構(gòu)減弱，細(xì)胞間脂質(zhì)的流動性顯著增加，使藥物更容易通過角質(zhì)層［10］，電阻測定結(jié)果表明，應(yīng)用薄荷醇后人體皮膚的電導(dǎo)率增加，通過打開架支撐的極性孔道，促進(jìn)藥物的通透［11］。本實驗中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的薄荷醇后新烏頭堿的累積透過量顯著地增加 (P＜0.05)。氮酮無色，無味，刺激性小，毒性低，是一種理想的促滲劑，能溶解脂質(zhì)后形成間隙或使該層細(xì)胞間脂質(zhì)排列有序性下降，增加藥物的透皮吸收［12］。本實驗中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的氮酮后，新烏頭堿穩(wěn)態(tài)通透速率顯著性增加 (P＜0.05)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的丙二醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的薄荷醇有協(xié)同作用，兩者合用使新烏頭堿滲透速率提高了3.32倍，這可能是由于丙二醇在類脂極性基團(tuán)之間的親水區(qū)域分布，使薄荷醇容易分配進(jìn)入細(xì)胞間部位［13］。

通過研究不同促滲劑對風(fēng)濕痹痛方中君藥草烏中有效成分之一新烏頭堿透皮吸收的影響，得出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的薄荷醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的丙二醇的促滲效果最好，這為風(fēng)濕痹痛透皮吸收制劑處方的優(yōu)化提供了理論依據(jù)。

中藥，特別是中藥復(fù)方，藥味較多，所含成分復(fù)雜，體外透皮實驗只能選用有代表性的指標(biāo)成分進(jìn)行研究分析，因此實驗結(jié)果的真實性和實驗結(jié)論的可靠性有待研究。此外，體外透皮實驗失去了機體完整統(tǒng)一的內(nèi)環(huán)境和體液調(diào)節(jié)，研究結(jié)果與整體藥效的相關(guān)性，也需要進(jìn)一步考察［14］。

［1］陳 龍，蔡寶昌，馬 騁，等.草烏幾種炮制品的鎮(zhèn)痛作用比較［J］.中國中藥雜志，1995，20(1):20-22.

［2］程 薇，趙淑英，牛 欣.草烏提取物外用對大鼠足跖腫脹的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(2):284-286.

［3］顧圣瑩，丁雪鷹，高 靜，等.透皮促滲劑對雙烏跌打損傷藥方中胡椒堿體外經(jīng)皮滲透的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，30(4):454-459.

［4］鄭 妮，王 麗，劉曉秋，等.薄荷醇衍生物對蓽茇提取物貼劑中胡椒堿體外經(jīng)皮通透性的影響［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27(10):772-776.

［5］王 麗，鄭 妮，方 亮，等.滲透促進(jìn)劑對蓽茇提取物中胡椒堿體外經(jīng)皮吸收的影響［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27(1):20-23.

［6］馬 蕊，蔣宇軒，牛喜草，等.格列本脲乳膠劑的制備及初步藥效學(xué)［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25(11):845-849.

［7］譚 喆，方 亮，張晶穎.格列吡嗪乳膠處方篩選及初步藥動-藥效學(xué)［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27(3):174-179.

［8］荊蘊杰，方 亮，郭漢文.促進(jìn)劑對復(fù)方腳癬靈搽劑中小檗堿和黃芩苷體外經(jīng)皮吸收及其皮內(nèi)滯留量的影響［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25(9):679-683.

［9］李文蘭，王艷萍，季宇彬，等.滲透促進(jìn)劑對川烏總生物堿和新烏頭堿透皮吸收的影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42(17):1316-1320.

［10］Barry B W.Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery［J］.Eur J Pharm Sci，2001，14(2):101-114.

［11］趙利剛.新型薄荷醇酯類衍生物經(jīng)皮促透作用評價及其促透機理的初步研究［D］.沈陽:沈陽藥科大學(xué)，2009.

［12］侯雪梅，李國棟，李衛(wèi)華.化學(xué)促滲劑及機理的探討［J］.上海醫(yī)藥，2008，29(5):232.

［13］李 玲，李祖?zhèn)?，何宇?不同促滲劑對川白芷中歐前胡素透皮吸收的影響［J］.中成藥，2009，31(4):627-629.

［14］顧圣瑩，丁雪峰，高 靜，等.透皮促滲劑對雙烏跌打損傷方體外透皮吸收和體內(nèi)藥效的影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44(8):607-611.