欒海艷, 張建華, 趙曉蓮, 張雪松, 歐 芹(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)
糖尿病 (diabetes mellitus)在全球范圍內(nèi)已成為高發(fā)病種,并且患者常伴有肝功能異常,因此糖尿病肝病已越來越引起人們的重視。桔梗作為一種藥食通用的植物,其主要的藥理活性成分是三萜皂苷[1],也是桔??傇碥盏闹饕煞郑渚哂性S多生物活性,尤其在降血糖、降脂和保肝方面有良好療效。本實(shí)驗(yàn)主要研究它對新近發(fā)現(xiàn)的一種糖、脂代謝調(diào)節(jié)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9,BMP-9)的作用,此研究在國內(nèi)外尚未見報道,希望能為糖尿病肝病的治療提供一個新的靶點(diǎn)及方法。
1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組 純系Wistar大鼠60只,清潔級,體質(zhì)量180~220 g,雌雄各半,購于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為2組:正常對照組10只給予正常飲食,糖尿病肝病造模組50只給予高脂高糖飲食加尾靜脈一次性注射2%鏈脲佐菌素(25 mg/kg)進(jìn)行2型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus)肝病造模,并進(jìn)行空腹血糖 (fasting blood sugar,F(xiàn)BG)及肝功測定,F(xiàn)BG≥16.8 mmol/L、肝功異常為造模成功[2]。將造模成功的40只2型糖尿病肝病模型大鼠隨機(jī)分為4組:模型對照組、桔??傇碥盏蛣┝拷M、桔??傇碥罩袆┝拷M和桔??傇碥崭邉┝拷M,繼續(xù)高脂高糖飲食;喂飼基礎(chǔ)飼料的10只作為正常對照組。
1.2 給藥方案 從第10周起桔梗總皂苷低、中和高劑量組分別給予桔??傇碥账芤?0、100、200 mg/(kg·d)灌胃;正常對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃,藥物干預(yù)12周。
1.3 留取標(biāo)本及檢測指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,稱量每只大鼠體質(zhì)量。取血,檢測 FBG、血脂、肝功及肝組織中 BMP-9 mRNA的表達(dá)水平。
1.4 試劑 桔??傇碥?(西安冠宇生物技術(shù)有限公司,藥品純度:80.75%,批號:GY20080225,符合《中國藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn);鏈脲佐菌素 (Sigma公司);引物 (北京奧科鼎盛生物科技有限公司);FBG、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate transaminase,AST)試劑盒 (南京建成生物工程研究所);RT-PCR試劑盒、Trizol總RNA試劑、DNA maker(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。
1.5 檢測指標(biāo) ①采用全自動生化分析儀檢測血糖、血脂[包括甘油三酯 (triglyceride,TG)、總膽固醇 (total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白 (low-density lipoprotein,LDL),高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein,HDL)]及肝功的變化;②采用RT-PCR法檢測BMP-9 mRNA的表達(dá)變化,以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列如下:β-actin上游5'TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA 3'下游5'TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3';BMP-9上游5'GGG ACC AAG GAG ACC AGA CTG 3'下游 5'CGC CCA TGT CAT CCT TGT AGA 3'。
1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理,數(shù)據(jù)以±s表示;組間比較采用單因素方差分析,以P<0.01為有顯著差異。
2.1 各組大鼠治療后FBG、TG、TC、LDL及HDL的變化與模型對照組相比,桔??傇碥崭邉┝拷M的FBG水平顯著降低(P<0.01),且已達(dá)正常標(biāo)準(zhǔn),TG、TC、LDL水平顯著降低 (P<0.01),HDL水平顯著增高 (P<0.01);桔??傇碥罩袆┝拷M的TG、TC水平明顯降低 (P<0.05)(見表1)。
表1 各組大鼠FBG、TG、TC、LDL及HDL的變化 (±s,n=8)
表1 各組大鼠FBG、TG、TC、LDL及HDL的變化 (±s,n=8)
注:與正常對照組相比,**P<0.01,*P<0.05;與模型對照組相比,##P<0.01,#P<0.05。下表同。
組別 FBG/(mmol·L -1) TG/(mmol·L -1) TC/(mmol·L -1) LDL/(mmol·L -1) HDL/(mmol·L -1)正常對照組 8.958±2.835 0.762±0.251 1.732±0.215 0.216±0.176 2.925±0.352模型對照組 21.583±3.742** 2.982±0.137** 4.543±0.146** 0.882±0.254** 1.463±0.437**桔??傇碥盏蛣┝拷M 19.463±2.256** 2.785±0.265** 4.353±0.198** 0.814±0.189** 1.514±0.267**桔??傇碥罩袆┝拷M 17.351±3.463** 2.673±0.164**# 4.160±0.304**# 0.798±0.226** 1.725±0.168**桔??傇碥崭邉┝拷M 12.468±3.863## 2.053±0.130**## 2.195±0.227**## 0.459±0.167*## 2.597±0.242##
2.2 各組大鼠治療后肝功能及肝組織中BMP-9 mRNA表達(dá)的變化 與模型對照組相比,桔??傇碥崭邉┝拷M的ALT明顯降低 (P<0.05),AST水平顯著降低 (P<0.01),肝組織中BMP-9 mRNA的表達(dá)顯著增加 (P<0.01);桔??傇碥罩袆┝拷M的BMP-9 mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)(見表2,圖1)。
表2 各組大鼠治療后ALT、AST及肝組織中BMP-9 mRNA表達(dá)的變化 (±s,n=8)
表2 各組大鼠治療后ALT、AST及肝組織中BMP-9 mRNA表達(dá)的變化 (±s,n=8)
組別 ALT/(mmol·L -1) AST/(mmol·L -1) (BMP-9/β-actin)正常對照組67.372±25.527 99.367±18.153 0.981±0.028模型對照組 129.437±29.663** 281.593±39.462** 0.417±0.041**桔??傇碥盏蛣┝拷M 116.458±31.575* 270.468±41.467** 0.464±0.053**桔??傇碥罩袆┝拷M 108.642±30.749* 258.141±17.456** 0.491±0.032**#桔梗總皂苷高劑量組 80.721±19.573# 196.462±27.942**## 0.739±0.077**##
圖1 各組大鼠治療后肝組織中BMP-9 mRNA的表達(dá)
2型糖尿病患者常同時伴有肥胖、高脂血癥,并更容易伴發(fā)肝臟損害。肝臟并發(fā)癥已成為糖尿病慢性并發(fā)癥中除腎臟、心臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)病變外另一個日益引起人們重視的慢性并發(fā)癥。肝臟是三大物質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)換中心,它對血糖、血脂調(diào)控功能正常與否在糖尿病的形成因素中起著重要的作用,因此保護(hù)好肝臟功能對治療2型糖尿病起著至關(guān)重要的作用。作為藥食同源的傳統(tǒng)中藥,桔梗的皂苷類成分具有抗肝脂質(zhì)過氧化,保護(hù)肝細(xì)胞,促進(jìn)肝臟的物質(zhì)和能量代謝加速肝損傷恢復(fù),改善肝臟微循環(huán),抑制肝腫瘤細(xì)胞等作用[3]。已有文獻(xiàn)報道,桔梗皂苷能降低高脂大鼠的血脂水平[4],通過對胰脂肪酶活性的抑制作用進(jìn)而抑制對食物脂肪吸收[5-6],并且這些作用是與其劑量大小有一定的相關(guān)性[7];前期研究也表明,桔??傇碥漳苊黠@降低大鼠的血糖血脂水平,改善肝損傷[8-9]。在本研究中,桔??傇碥漳苊黠@降低2型糖尿病大鼠的血糖、改善血脂代謝紊亂、保護(hù)肝功能,此外它還能對新的糖脂代謝調(diào)節(jié)因子BMP-9有著很好的調(diào)節(jié)作用,上調(diào)其在糖尿病肝臟組織中的表達(dá),并且桔??傇碥盏倪@些功能隨著它的劑量增大而增強(qiáng)。BMP-9屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族,主要在肝臟表達(dá),與糖、脂代謝中多個關(guān)鍵轉(zhuǎn)變環(huán)節(jié)有直接相關(guān)性[10],它具有部分類似胰島素的糖代謝調(diào)節(jié)作用,并與胰島β細(xì)胞的胰島素分泌有直接相關(guān)性。Chen等的研究發(fā)現(xiàn),BMP-9能阻遏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的合成,并激活絲/蘇氨酸激酶,從而可能抑制肝內(nèi)糖異生并促進(jìn)肌糖原合成以降低血糖;同時,BMP-9還能促進(jìn)蘋果酸酶和脂肪酸合酶的合成[11]。BMP-9與瘦素作用相似可提高糖脂平衡,促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖,而與抵抗素和抵抗素樣蛋白抑制脂肪細(xì)胞分裂和分化的作用相反[12]。所以桔??傇碥諏MP-9 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用對減輕2型糖尿病大鼠肝臟的損傷有非常重要的意義。
綜上,桔??傇碥漳苡行Ц纳?型糖尿病肝病大鼠肝損害,但有關(guān)其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制,尚有待于進(jìn)一步的深入和完善。
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