虎掌南星藥材的質(zhì)量標準研究

陸 丹， 池玉梅， 趙懿清， 吳 皓

(1.無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫 214000;2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210046)

虎掌南星 (掌葉半夏)，為天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisectaSchott的干燥塊莖［1］，尚未被《中國藥典》收載，含有生物堿類、苷類、二肽類、氨基酸、凝集素、甾醇類、脂肪酸、糖、微量元素、核苷等成分［2］，因其具有祛風定驚、降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效［3］，臨床上常代用天南星、半夏或混用，迄今有關(guān)天南星科植物的毒性及炮制機制研究較多［4-11］，而虎掌南星系統(tǒng)的質(zhì)量標準研究報道尚少。前期測試結(jié)果表明，天南星富含黃酮類成分，半夏富含有機酸類成分，虎掌南星富含核苷類成分，且核苷類成分大多具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的活性［12］，因此選擇核苷類成分作為研究對象，兼顧各批次藥材核苷類成分的含有情況，最終選擇腺嘌呤和尿苷作為指標成分，本實驗對購自各地的虎掌南星藥材進行性狀鑒定、顯微鑒別，對藥材的水分、灰分、浸出物進行測定，并對指標成分腺嘌呤、尿苷進行薄層鑒別和定量測定，為虎掌南星藥材質(zhì)量標準的建立奠定基礎。

1 儀器、試劑與材料

OlympusDX60多功能顯微鏡 (Olympus公司)，Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測器 (美國Waters公司)。

AB-8型大孔樹脂 (天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司)，硅膠GF254預制薄層板 (青島海洋化工集團公司)，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(MERCK公司)，水為Millipore純水器制得的超純水，其他試劑為分析純;

腺嘌呤、尿苷 (純度均大于99%，美國Sigma公司)。13批虎掌南星，購自各產(chǎn)地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學談獻和教授鑒定為天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisectaSchott的干燥塊莖，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 塊莖呈不規(guī)則的扁球形，直徑2～5 cm，有主塊莖及多數(shù)附著的小塊莖組成，形如虎的腳掌。表面淡黃色或淡棕色，主塊莖頂端有凹陷的莖痕，周圍有點狀根痕。質(zhì)堅實而重，斷面不平坦，色白，富粉性。氣微，味辛辣，有麻舌感。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 以水裝片觀察藥材所含的淀粉粒，以水合氯醛透化裝片觀察藥材所含的草酸鈣針晶和導管。本品為類白色或淡黃色粉末，淀粉粒單粒呈類圓形、橢圓形或圓多角形，直徑2～30 μm，臍點裂縫狀、圓點狀、 “人”字狀或星狀;復粒較多，由2～10分粒組成。草酸鈣針晶束存在于黏液細胞中或散在，長20～65 μm，黏液細胞直徑60～130 μm。螺紋導管直徑12～27 μm。

2.2.2 薄層鑒別［13］取虎掌南星藥材5 g(60目)于100 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，密塞，超聲 (工作頻率40 kHz，功率250 W)提取60 min，過濾，濾液揮除乙醇，通過AB-8大孔吸附樹脂柱 (內(nèi)徑1 cm，長15 cm)，以水100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣以1 mL乙醇復溶，離心，取上清液作為供試品溶液。另取腺嘌呤和尿苷對照品，加純水制成1 mg/mL的混合對照品溶液。照薄層色譜法 (2010年版《中國藥典》一部附錄VI B)試驗，吸取對照品溶液2 μL和供試品溶液8 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-異丙醇-水-氨水 (8∶2∶6∶0.6∶0.2)為展開劑，飽和30 min，上行展開10 cm，取出，晾干，紫外燈 (254 nm)下檢視，供試品色譜中 (順序見表1)，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同暗斑，見圖1。

圖1 虎掌南星薄層鑒別色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of Pinelliae pedatisectae Rhizoma

2.3 水分、灰分及浸出物檢查［13］13批次藥材按照2010年版《中國藥典》一部附錄IX H水分測定法項下“烘干法”進行水分測定，附錄IX K灰分測定法項下“總灰分測定法”及“酸不溶性灰分測定”進行灰分測定，附錄X A浸出物測定法項下“醇浸出物測定法 (熱浸法)”，以50%乙醇為溶劑進行浸出物測定，結(jié)果見表1。

測定結(jié)果表明，13批虎掌南星藥材各項檢查結(jié)果差異較大，各批次平均含水量為12.93%，總灰分和酸不溶性灰分分別為3.92%和0.13%，醇溶性浸出物為11.57%。參照國家藥典委要求，平均含有量的80%和120%分別設置為下限和上限，故建議水分不得超過15.0%，總灰分不得超過5.0%，酸不溶性灰分不得超過0.5%，醇溶性浸出物不得少于9.0%。

2.4 腺嘌呤和尿苷測定［14-16］

2.4.1 對照品貯備液的配制 精密稱取腺嘌呤和尿苷對照品各10 mg，分別加水定容至10 mL量瓶中，制成1 mg/mL的相應對照品貯備液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取虎掌南星藥材粗粉(60目)0.6 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入水10 mL，稱定質(zhì)量，超聲 (頻率40 kHz，功率250 W)45 min，取出，放冷，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，取適量溶液離心5 min(15 000 r/min)，取上清液，即得。

2.4.3 色譜條件及系統(tǒng)適應性 選用Lichrospher C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm;5 μm)，流動相為乙腈 (A)-水 (B)體系 (含0.1%甲酸)，梯度洗脫，0→6 min(0%A)，25 min(10%A)，29 min(25%A);采用254 nm作為檢測波長，體積流量為1.0 mL/min，柱溫30℃;進樣量20 μL。

表1 虎掌南星檢查項測定結(jié)果 (%，n=3)Tab.1 Results of the inspection items of Pinelliae pedatisecta Rhizoma(%，n=3)

結(jié)果顯示，腺嘌呤和尿苷的保留時間分別為2.8 min和6.4 min，與其相鄰的色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按腺嘌呤峰和尿苷峰計均大于3 000，對照品與供試品色譜圖見圖2。

圖2 對照品 (A)與樣品 (B)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and samples(B)

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密移取各貯備液適量，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，得對照品混合溶液，含腺嘌呤和尿苷質(zhì)量濃度分別為50.23 mg/L和51.50 mg/L，采用二倍稀釋法連續(xù)稀釋5次，得1、2、3、4、5、6號對照品溶液。

上述各溶液按2.4.3項下條件分析，以峰面積為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標作標準曲線，得腺嘌呤回歸方程Y1=96 660X1－2 121.6(r=0.999 9)，尿苷回歸方程Y2=42 017X2－1 639.8(r=0.999 9)，結(jié)果表明腺嘌呤和尿苷分別在1.6～50.2 mg/L和1.6～51.5 mg/L呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗 取2.4.4項下4號對照品溶液，連續(xù)進樣6次分析，腺嘌呤和尿苷對應的色譜峰峰面積RSD分別為1.0%、0.9%，說明儀器精密度良好。

2.4.6 重復性試驗 以2.4.2項下方法平行處理同一份藥材 (批號080812，60目)6份，分別進樣分析，計算腺嘌呤和尿苷的峰面積 RSD分別為2.2%、1.6%，說明方法重復性好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 同一份重復性試驗樣品分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，計算腺嘌呤和尿苷的峰面積RSD分別為0.8%、1.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗 分別精密吸取2.4.1項下腺嘌呤和尿苷對照品貯備液0.72、0.77 mL置100 mL量瓶中，用水定容，搖勻，得混合對照品溶液。取已知含有量的藥材 (批號080812，60目)0.3 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入10 mL上述溶液，余下操作步驟同2.4.2項下供試品溶液制備方法，平行6份，進樣分析，采用外標法，腺嘌呤和尿苷分別以各自回歸方程計算，統(tǒng)計RSD，結(jié)果顯示回收率分別為99.44%、100.55%，RSD均小于3.0%，符合定量測定要求，見表2。

2.4.9 樣品測定 以建立的方法測定13批虎掌南星藥材供試品中腺嘌呤和尿苷的量，統(tǒng)計各批次平行樣品間以及各產(chǎn)地兩種核苷量的RSD，見表3。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地兩種核苷的總量具有一定差異，最低有0.27 mg/g，最高可達0.90 mg/g，平均含有量為0.05%，綜合考慮，建議虎掌南星藥材中腺嘌呤和尿苷的總量不得低于0.04%。

表2 腺嘌呤和尿苷加樣回收實驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for adenine and uridine(n=6)

表3 樣品中腺嘌呤、尿苷的測定 (n=3)Tab.3 Determination of adenine and uridine in samples(n=3)

3 討論

實驗中發(fā)現(xiàn)虎掌南星酸不溶性灰分含有量較低，該檢查項各批次平行樣品間、各產(chǎn)地間相對標準偏差較大，應該與此有關(guān)。由于藥材中淀粉量較大，且前期試驗表明藥材所含揮發(fā)性成分極少，因而直接選擇乙醇作為溶劑進行浸出率實驗，根據(jù)其化學成分的溶解性特點，選擇熱浸法實驗，以藥材的浸出率為指標，試驗了不同乙醇體積分數(shù)，最終確定采用50%乙醇作為提取試劑。

大量的糖類成分使虎掌南星藥材在提取濃縮后，點板不易展開，加之鑒別對象在藥材中含有量較低，用AB-8型大孔樹脂吸附，水洗脫，乙醇復溶可達到去糖、純化、富集的目的，滿足了薄層展開要求。薄層色譜結(jié)果表明，采用薄層色譜法可以檢出13批樣品均含有腺嘌呤和尿苷，且斑點清晰，方法簡捷、可行，故此方法可作為虎掌南星藥材的定性鑒別依據(jù)。

本實驗以腺嘌呤和尿苷的量作為虎掌南星藥材質(zhì)量控制的定量標準，含有量測定實驗中考察了甲醇-水和乙腈-水體系作為流動相，結(jié)果顯示乙腈-水體系較佳。為改善峰形，考察了流動相中分別加入甲酸、醋酸和磷酸，結(jié)果顯示加入甲酸效果較好，經(jīng)過試驗最終確定加入量為0.1%。以峰形和分離度為指標，分別考察體積流量和柱溫，最終確定體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30℃。由于藥材中含大量淀粉，不宜用回流法提取，直接選用超聲法提取。試驗分別用水和不同體積分數(shù)的乙醇提取，最終選擇提取效率最高的水作為提取溶劑?？疾炝弦罕葹?∶10、1∶25、1∶50時的提取效果，結(jié)果顯示，1∶10的料液比已可基本提取完全，綜合考慮易操作性及色譜峰面積的適宜性等因素，采用0.6 g藥材使用10 mL提取溶劑的方法?？疾斐晻r長為30、45、60 min的提取效果，結(jié)果顯示45 min已可基本提取完全，確定45 min為超聲時長。上述條件可滿足含有量測定的要求，該方法簡捷，結(jié)果準確可靠，重復性好，可用于虎掌南星藥材的質(zhì)量控制。

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