夜香樹葉甾體皂苷的體外抗腫瘤活性

趙世元， 農(nóng)智新*， 葉海洪， 鐘振國， 張明艷， 李彩萍

(1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院，廣西南寧 530001;2.廣西中醫(yī)學院新藥開發(fā)中心，廣西南寧 530001)

夜香樹，又名夜來香，茄科夜香樹屬植物Cestrum nocturnumLinn.，前期研究發(fā)現(xiàn)夜香樹葉中正丁醇部位具有體內(nèi)外抗腫瘤作用［1-7］。為了闡明該部位抗腫瘤的物質(zhì)基礎，本實驗對夜香樹葉正丁醇部位的化學成分進行了研究，分離出3個皂苷化合物，并對3個化合物以MTT為手段進行體外抗腫瘤活性檢測，根據(jù)實驗結(jié)果探討其構(gòu)效關(guān)系與抗腫瘤活性之間的關(guān)系，為獲取來源于植物的高效細胞毒類抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥物 夜香樹葉及嫩枝采自廣西南寧市郊，經(jīng)廣西中醫(yī)學院藥用植物教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為茄科屬植物夜香樹Cestrum nocturnumLinn.。

1.2 細胞株 人肝癌細胞BEL7404、宮頸癌細胞株HeLa、人肺癌細胞A549株，由中國科學院上海細胞生物研究所提供。

1.3 試劑 柱層析用硅膠 (100～200目)、薄層層析硅膠 (200～300目)購自青島海洋化工廠;MTT(四甲基噻唑藍)為德國 Sigma公司生產(chǎn);FBS(胚胎牛血清)為美國 Hyclone公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)基為美國GIB-CO公司產(chǎn)品。

1.4 儀器 UV Agilent 8453紫外可見分光光度計(波長范圍190～800 nm，分辨率0.1 nm。)美國安捷倫公司;IR EQUINOX 55型傅里葉變換紅外光譜儀 (分辨率優(yōu)于0.2 cm－1;波數(shù)范圍7 500～370 cm－1)，德國Bruker公司;NMR INOVA 500NB超導核磁共振譜儀，美國varian公司;MS ZAB-HS雙聚焦磁質(zhì)譜儀，英國VG公司;熔點測定儀，XT4—100A(控溫型)，北京科儀電光儀器廠。

2 方法

2.1 藥物提取與分離 取干燥的夜香樹葉及嫩枝2.3 kg，用乙醇浸泡24 h，加熱回流提取，過濾，減壓濃縮得浸膏，乙醇浸膏用硅膠拌勻后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。取正丁醇部位浸膏100 g，用硅膠拌勻后，采用硅膠柱色譜法分離，先用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，經(jīng)薄層檢識后將相同的溶液合并，到三氯甲烷-甲醇比例為20∶1，發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶析出，經(jīng)反復硅膠柱層析，三氯甲烷甲醇混合物液洗脫，甲醇結(jié)晶。得到3種甾體皂苷化合物。

2.2 細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的人肝癌細胞BEL7404，宮頸癌細胞 HeLa，人肺癌細胞 A549，用0.25%胰蛋白酶消化后，用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成5 000個/mL的細胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL上述細胞懸液，置37℃，10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，小心地吸去上清液，實驗組分別加入終質(zhì)量濃度為60、30、15、7.5、3.8 μg/mL 含 10%FBS 的 RPMI-1640培養(yǎng)液的3種皂苷;陽性對照組加入終質(zhì)量濃度為30 μg/mL的5-氟脲嘧啶含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，對照組則加入200 μL的10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的細胞懸液，每組4孔(實驗重復3次)。置37℃，10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后棄去上清液，加入200 μL/孔新鮮配制的含0.2 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入200 μl/孔DMSO，振蕩混勻后，在酶標儀上以波長為550 nm，參比波長為450 nm測定OD值，測定時減去空白對照。按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率:腫瘤細胞生長抑制率%=(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色針晶，63.8 mg，負離子FABMS在m/z1 209.6處可見準分子離子峰 ［M-H］－，表明相對分子質(zhì)量為1 209.56。IR(KBr)譜顯示有羥基 (3 360 cm－1)和羰基(1 035，895＞925 cm－1)吸收。1H-NMR(400.13 MHz，pyridine-d5)δ:4.9(d，J=7.5 Hz，Gal H－1)，5.55(d，J=7.8 Hz，Glc-ⅠH-1)，5.8(d，J=7.6 Hz，Glc-ⅡH-1)，5.14(d，J=7.8 Hz，Glc-Ⅲ H-1)，5.08(d，J=7.7 Hz，Glc-Xyl H-1)。13C-NMR(100.77 MHz，pyridine-d5) δ:45.73(C-1)，70.66(C-2)，84.57(C-3)，37.61(C-4)，140.08(C-5)，121.90(C-6)，32.12(C-7)，31.61(C-8)，50.20(C-9)，37.95(C-10)，21.20(C-11)，39.80(C-12)，40.47(C-13)，56.52(C-14)，32.12(C-15)，81.10(C-16)，62.85(C-17)，16.85(C-18)，20.45(C-19)，41.99(C-20)，15.01(C-21)，109.26(C-22)，31.84(C-23)，29.28(C-24)，31.12(C-25)，66.80(C-26)，17.32(C-27)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結(jié)合相關(guān)文獻［8］的比較，化合物1可確定為 spirost-5-ene-2，3-diol［2α，3β，25R］3-O-［β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl{(3→1)-β-D-xylopyranosyl}(1→4)-β-D-galactopyranoside(即nocturnoside A)。結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compound 1

化合物2:白色針晶，1.85 g，陽離子 FABMS在m/z可見1 015.5520［M-H］+，869［M+H-146］+，723［M+H-(2×146)］+，577［M+H-(3×146)］+，415 ［M+H-(3×146)-162］+，397［M+H-(3×146)-162-18］+，負離子 FABMS在m/z1 209.6處可見1 013.533 0［M-H］－，867［M-H-146］－，721 ［M-H-(2×146)］－。IR(KBr)表明相對分子質(zhì)量為1 015.6。IR(KBr)譜顯示有羥基 (3 400 cm－1)和羰基 (1 440 cm－1)，亞甲級伸縮振動 (2 910 cm－1)等特征信號。1H-NMR(400.13 MHz，pyridine-d5)δ:4.9(d，J=6.5 Hz，Glc H-1)，5.81(d，J=2.8 Hz，Rha-Ⅲ H-1)，6.26(d，J=7.6 Hz，Glc-ⅡH-1)，5.14(d，J=7.8 Hz，Glc-Ⅲ H-1)，5.08(d，J=3.6 Hz，Rha-I H-1);以及 6.37(d，J=3.6 Hz，Rha-II H-1)。13C-NMR(100.77 MHz，pyridine-d5)δ:37.58(C-1)，29.34(C-2)，77.79(C-3)，39.05(C-4)，140.92(C-5)，121.85(C-6)，32.29(C-7)，31.91(C-8)，50.41(C-9)，37.20(C-10)，21.10(C-11)，39.05(C-12)，40.54(C-13)，57.74(C-14)，31.91(C-15)，81.17(C-16)，62.99(C-17)，16.39(C-18)，19.47(C-19)，42.06(C-20)，15.07(C-21)，109.32(C-22)，31.92(C-23)，29.34(C-24)，30.67(C-25)，66.95(C-26)，17.38(C-27)。

以上數(shù)據(jù)與文獻［9］資料檢索比對，特別是氫譜和碳譜的數(shù)據(jù)對照分析，該化合物鑒定為spirost-5-ene-3-diol［3β，25R］3-O-［{α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)}-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)］-β-D-glucopyranoside(即nocturnoside B)。結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2 化合物2的化學結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of compound 2

化合物3:白色針尖狀，65.3 mg，mp 278～283℃。FAB-MS:m/z1 047.500［M-H］，915［M-H-132］，885 ［M-H-162］，753 ［M-H-(132-162)］，591 ［M-H-132-(2×162)］。IR Vmaxkbr(cm－1):3 410(OH)，107(OH)，1 420(C==C)，1 390(C==C)，980，918，8 967。13C-NMR(100.61 MHz，pyridine-d5)δ:45.6(C-1)，70.7(C-2)，84.5(C-3)，37.6(C-4)，140.1(C-5)，121.7(C-6)，32.1(C-7)，31.0(C-8)，50.1(C-9)，37.8(C-10)，21.1(C-11)，39.1(C-12)，40.5(C-13)，56.4(C-14)，32.1(C-15)，81.2(C-16)，62.8(C-17)，16.2(C-18)，20.4(C-19)，41.9(C-20)，14.9(C-21)，109.2(C-22)，31.7(C-23)，29.2(C-24)，30.5(C-25)，66.8(C-26)，17.2(C-27)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結(jié)合相關(guān)文獻［10］的比較，化合物3可確定為spirost-5-ene-23-diol［2α，3β，25R］3-O-［β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl}(1→4)-β-D-galactopyranoside。

3.2 夜香樹葉中3種皂苷的體外對3種腫瘤細胞的增殖抑制作用

夜香樹葉3種甾體皂苷體外抗腫瘤實驗結(jié)果見表1。從表1可以看出:3種化合物均可抑制BEL7404、HeLa、A549腫瘤細胞的生長，且對這3種腫瘤細胞的抑制作用呈明顯的劑量和時間依賴關(guān)系，在質(zhì)量濃度相同的3種化合物中，化合物2對3種腫瘤細胞生長的抑制作用較明顯。

表1 夜香樹葉3種化合物對人肝癌細胞BEL7404、宮頸癌細胞HeLa、人肺癌細胞A549增殖抑制作用 (±s，n=6)Tab.1 Proliferation of three compounds on human hepatoma cell BEL7404，cervical cancer cells HeLa and human lung cancer cell line A549(±s，n=6)

表1 夜香樹葉3種化合物對人肝癌細胞BEL7404、宮頸癌細胞HeLa、人肺癌細胞A549增殖抑制作用 (±s，n=6)Tab.1 Proliferation of three compounds on human hepatoma cell BEL7404，cervical cancer cells HeLa and human lung cancer cell line A549(±s，n=6)

藥物 質(zhì)量濃度/(μg·mL－1 BEL7404細胞增殖抑制率/% HeLa細胞增殖抑制率/%A549細胞增殖抑制率/%2 18.2±4.4 7.5 12.3±3.4 23.6±5.2 40.61±5.1 48.2±5.2 8.2±2.4 42.53±5.1 15 20.6±3.6 40.2 ±5.5 58.8±6.2 67.6±6.4 20.6±3.2 60.2±5.7 30 40.3±3.5 68.3±5.7 68.6±5.4 76.3±5.7 33.2±3.5 76.5±6.5 60 65.5±6.7 80.2±6.4 78.3±6.3 90.2±9.6 52.6±6.4 86.9±7.3化合物2 3.8 8.4±2.6 16.8±4.5 22.2±5.3 23.4±4.3 6.3±1.5 21.3±4.5 7.5 15.2±3.5 33.3±4.2 43.6±4.5 53.2±4.8 10.3±2.2 45.2±3.8 15 25.8±4.3 63.3±5.8 60.3±4.5 75.2±6.8 23.1±4.3 78.2±6.8 30 56.3±4.8 83.3±7.5 71.6±4.6 80.2±7.6 40.3±5.2 82.9±7.5 60 70.2±5.2 90.3±8.9 82.6±5.3 93.2±9.6 60.5±5.2 91.2±8.4化合物3 3.8 5.3±1.7 7.5±1.4 17.2±3.5 19.6±4.8 4.1±1.4 19.5±4.2 7.5 10.2±3.5 20.5±4.8 38.1±4.2 46.5±5.2 6.8±1.6 39.5±4.2 15 18.4±3.6 38.2±4.5 56.8±5.8 64.2±6.2 18.1±3.4 57.3±5.7 30 37.8±4.5 65.3±5.6 65.5±5.4 73.8±6.3 30.8±5.2 74.1±6.5 60 62.5±5.8 78.4±7.6 75.4±5.6 86.4±6.9 48.8±4.3 83.4±7.8 5-氟尿嘧啶 30 48.2±5.1 63.2±6.5 50.2±5.4 70.2±7.3 45.4±48 h 72 h 48 h 72 h 48 h 72 h化合物1 3.8 6.3±2.1 8.1±3.6 19.4±4.3 21.6±4.2 5.3±1.)3.9 68.6±7.2

4 討論

甾體皂苷廣泛存在于動植物中，很多食物和蔬菜如燕麥、花生、大豆、扁豆、大蒜、菠菜、洋蔥、蘆筍、棗子和茶葉都含有相當高的甾體皂苷量，很多中藥如人參、甘草、馬栗樹、三葉草、報春花都含有甾體皂苷。研究發(fā)現(xiàn)甾體皂苷有很多生理學和藥理學活性，如抗腫瘤、抗炎，抗心血管系統(tǒng)疾病和細胞毒活性等。連接在苷元上的糖苷在生理學和藥理學發(fā)揮很大的作用。據(jù)文獻［11-12］報道，皂苷分子3號位上的碳原子與糖基連接方式與其抗腫瘤作用有關(guān)，糖基數(shù)量影響抗腫瘤活性的強度。含有鼠李糖結(jié)構(gòu)的皂苷抗腫瘤活性比阿拉伯糖、半乳糖 (galactopyranoside)和木糖 (xylopyranosyl)強，提示皂苷元上的各種糖基可能影響該化合物對腫瘤細胞的細胞毒性作用。

本實驗從夜香樹葉和嫩枝的正丁醇部位中分離得3種甾體皂苷，體外實驗，從MTT結(jié)果可以看出，3種皂苷對BEL7404、HeLa、A549等腫瘤細胞均有顯著的增殖抑制作用，其中化合物2對腫瘤細胞的毒性最強。分析這3個化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，化合物2中有3個鼠李糖 (rhamnopyranosyl)和1個吡喃葡萄糖 (glucopyranoside)，該化合物在夜香樹葉和嫩枝的正丁醇部位的量達1.85%，可能是抗腫瘤作用的主要成分?；衔?、化合物3的量較少，在夜香樹葉和嫩枝的正丁醇部位含有量小于0.5%，他們在分子結(jié)構(gòu)中苷元側(cè)鏈上糖基數(shù)量雖多，但沒有鼠李糖基團，故抗腫瘤作用稍弱。

從中草藥中尋找天然抗腫瘤活性成分是抗癌藥物研究的一個重要途徑和研究熱點。夜香樹葉甾體皂苷體外試驗的結(jié)果可看到腫瘤治療的希望，本課題組正在研究甾體皂苷的苷元和糖基的連接方式以及抗腫瘤作用的相關(guān)性，為下一步結(jié)構(gòu)修辭和合成新的較強的抗腫瘤、低毒的化合物打好基礎。

［1］趙世元，鐘振國，廖 文，等.夜香樹提取物體外抗腫瘤作用的實驗研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20(1):125-128.

［2］鐘振國，趙世元，呂金燕，等.夜香樹提取物體體內(nèi)抗腫瘤作用的實驗研究［J］.中藥材，2008，31(11):1709-1712.

［3］鐘振國，趙世元.夜香樹及其提取物在抗腫瘤方面的應用:中國，1907382［P］.2007-02-07.

［4］羅發(fā)軍，趙世元，鐘振國，等.夜香樹提取物對小鼠白血病L1210細胞生長的抑制作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(2):335-336.

［5］盧紅梅，鐘振國，趙世元，等.夜香樹花提取物體外抗腫瘤作用的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(7):1704-1705.

［6］趙世元，農(nóng)智新，葉海洪，等.夜香樹葉甾體皂苷對人肝癌細胞株BEL-7404增殖抑制作用機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(7):203-207.

［7］趙世元，黃之虎，葉海洪，夜香樹花甾體皂苷誘導K562細胞凋亡機制研究［J］.中成藥，2013，35(3):15-17.

［8］Mimaki Y，Watanabe K，Sakagami H，et al.Steroidal glycosides from the leaves ofCestrum nocturnum［J］.Proc Natl Chem Conf(Ⅱ)Karachi，1990，32(3):288-289.

［9］Ahmad V U，Baqai F T，F(xiàn)atima I，et al.A Spirostanol glycosides fromCestrum nocturnum［J］.Phytochemistry，1991，30(9):357-359

［10］Mimaki Y，Watanabe K，Sakagami H，et al.Steroidal glycosides from the leaves ofCestrum nocturnum［J］.J Nat Prod，2002，65(12):1863-1868

［11］Wang Y，Zhang Y，Zhu Z，et al.Exploration of the correlation between the strcture，hemolytic activity，and cytotoxicity of steroid saponins［J］.BioorgMedChem，2007，15(2):2528-2532.

［12］Bachran C，Sutherland M，Heisler I，et al.The saponin mediated enhanced uptake of targeted saponin-based drugs is strongly dependent on the saponin structure［J］.Exp Biol Med，2006，231(3):412-420.