紅花清肝十三味丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉 穎， 胡 琴*， 史文鳳

(1.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035;2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院，山西長(zhǎng)治 046000)

紅花清肝十三味丸來(lái)源于《蒙醫(yī)驗(yàn)方》，1984年收載入《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》，2001年收載入《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊(cè))。原標(biāo)準(zhǔn)收載了顯微鑒別以及兩個(gè)理化鑒別［1］。為控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)處方中紅花、丁香、木香、訶子、梔子、紫檀香、人工牛黃進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定了制劑中梔子苷、羥基紅花黃色素A、丁香酚。所建立的方法具有操作簡(jiǎn)便、分離效果好、重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津LC—20A高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器 (PDA)型;聚酰胺薄膜 (浙江省臺(tái)州路橋四甲生化塑料廠);硅膠G預(yù)制板 (煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所);硅膠G預(yù)制板 (青島海洋化工廠分廠)。

對(duì)照品:羥基紅花黃色素A(批號(hào)111637-200502)、丁香酚 (批號(hào)725-200209)、去氫木香內(nèi)酯 (批號(hào):111525-200706)、木香烴內(nèi)酯 (批號(hào):111524-200503)、沒(méi)食子酸 (批號(hào):110831-200803)、梔子苷 (批號(hào):110749-200714)、膽酸(批號(hào):100078-200414)、豬去氧膽酸 (批號(hào)100087-200610)。對(duì)照藥材:紅花 (批號(hào)120907-200609)、丁香 (批號(hào)121039-200503)，木香 (批號(hào)120921-200607)、訶子 (批號(hào)121015-200503)。對(duì)照品與對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

紅花清肝十三味丸樣品共11批:A(批號(hào):20120203);B(批號(hào):110525 071，110526 027);C(批 號(hào):10455001，10455002);D(批 號(hào):110825，110420，110419);E(批 號(hào):110925，111056，110946)。

甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 紅花及羥基紅花黃色素A的薄層鑒別

取本品3 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液作為供試品溶液。另取不含紅花的陰性制劑，同法制成紅花陰性溶液。另取紅花對(duì)照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min素A對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液及紅花陰性溶液5 μL，對(duì)照藥材溶液 2 μL，對(duì)照品溶液 1 μL，點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，以醋酸展開(kāi)，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。缺紅花陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 紅花清肝十三味丸中紅花及羥基紅花黃色素A的TLC圖譜Fig.1 TLC chromatogram of Carthami Flos and hydroxysafflor yellow A

2.2 丁香及丁香酚、木香及去氫木香內(nèi)酯的薄層色譜鑒別［2-4］

分別取不含丁香、木香的陰性制劑各3 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，分別作為丁香陰性溶液及木香陰性溶液。另取丁香對(duì)照藥材、木香對(duì)照藥材各1 g，分別加甲醇5 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。再取丁香酚對(duì)照品、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取2.1項(xiàng)下供試品溶液，丁香陰性溶液、木香陰性溶液及兩種對(duì)照藥材溶液各10 μL，兩種對(duì)照品溶液各5 μL，點(diǎn)于硅膠 G板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸 (15∶5∶1)展開(kāi)，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺丁香及缺木香陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.3 訶子及沒(méi)食子酸的薄層色譜鑒別

圖2 紅花清肝十三味丸中丁香、丁香酚、木香、去氫木香內(nèi)酯的TLC圖譜Fig.2 TLC chromatogram of Caryophylli Flos，eugenol，Aucklandiae Radix，dehydrocostuslactone

取不含訶子的陰性制劑3 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為訶子陰性溶液。另取訶子對(duì)照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。再取沒(méi)食子酸對(duì)照品1 mg，用1 mL甲醇溶解，作為對(duì)照品溶液。吸取2.1項(xiàng)下供試品溶液、訶子陰性溶液及對(duì)照藥材溶液各10 μL，對(duì)照品溶液3 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (5∶4∶1)展開(kāi)，噴以2%三氯化鐵乙醇液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺訶子陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.4 梔子苷的薄層色譜鑒別

取不含梔子的陰性制劑3 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為梔子陰性溶液。另取梔子苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取2.1項(xiàng)下供試品溶液、梔子陰性溶液各10 μL，對(duì)照品溶液2 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(6∶6∶1)展開(kāi)，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺梔子陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

2.5 紫檀香的薄層色譜鑒別［5-7］

圖3 紅花清肝十三味丸中訶子及沒(méi)食子酸的TLC圖譜Fig.3 TLC chromatogram of Chebulae Fructus and gallic acid

圖4 紅花清肝十三味丸中梔子苷的TLC圖譜Fig.4 TLC chromatogram of geniposide

取不含紫檀香的陰性制劑3 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為紫檀香陰性溶液。另取紫檀香對(duì)照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。吸取2.1項(xiàng)下供試品溶液、紫檀香陰性溶液各10 μL，對(duì)照藥材溶液3 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，以甲苯-丙酮 (7∶3)展開(kāi)，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺紫檀香陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖5。

2.6 膽酸、豬去氧膽酸的薄層鑒別

取不含人工牛黃的陰性制劑3 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為人工牛黃陰性溶液。另取膽酸對(duì)照品、豬去氧膽酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取2.1項(xiàng)下供試品溶液、人工牛黃陰性溶液各10 μL，對(duì)照品溶液2 μL，點(diǎn)于硅膠 G板上，以異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶7∶5)展開(kāi)，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈 (365 nm)下檢視。供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。缺人工牛黃陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖6。

圖5 紅花清肝十三味丸中紫檀香的TLC圖譜Fig.5 TLC chromatogram of Pterocarpi indici Lignum

圖6 紅花清肝十三味丸中膽酸、豬去氧膽酸的TLC圖譜Fig.6 TLC chromatogram of cholic acid and hyodeoxycholic acid

3 HPLC法測(cè)定梔子中梔子苷、紅花中羥基紅花黃色素A、丁香中丁香酚［8-9］

3.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為梔子苷238 nm，羥基紅花黃色素A 403 nm，丁香酚280 nm。理論板數(shù)按理論板數(shù)按梔子苷峰、羥基紅花黃色素A峰、丁香酚峰計(jì)算均應(yīng)不低于3 000。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相比例Tab.1 Gradient elution ratio using methanol-H2O

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取梔子苷對(duì)照品、羥基紅花黃色素A對(duì)照品和丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成每1 mL含梔子苷20 μg，羥基紅花黃色素 A 25 μg，丁香酚40 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性樣品溶液的制備 分別按處方比例及制劑制備工藝制備不含梔子、紅花、丁香的陰性樣品，再按3.3項(xiàng)下方法制備，即得。

3.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果紅花、丁香、梔子陰性樣品分別在羥基紅花黃色素A、丁香酚、梔子苷相應(yīng)保留時(shí)間處未見(jiàn)色譜峰，表明陰性樣品對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。見(jiàn)圖7～9。

3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為 0.106 5 mg/mL)1、6、12、15、18、21 μL;羥基紅花黃色素 A對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為 0.064 66 mg/mL)1、3、5、6、8、9、12 μL;丁香酚對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為0.227 8 mg/mL)1、5、9、15、18、21 μL，注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，其回歸方程:梔子苷為y=1 444 967.883 12x－8 515.467 88(r=1.000 0)，表明其在0.106 5～2.236 5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;羥基紅花黃色素A為y=2 913 887.269 01x－25 106.472 60(r=0.999 8)，表明其在0.064 66 ～0.775 92 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;丁香酚為y=973 750.233 23x+5 538.847 34(r=1.000 0)，表明其在0.227 8～4.783 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液 (批號(hào):20120203)，按3.1項(xiàng)，分別在制備后0、4、8、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積RSD梔子苷為0.54%，羥基紅花黃色素A為2.2%，丁香酚為0.73%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，依法測(cè)定。結(jié)果梔子苷RSD為0.73%;羥基紅花黃色素A RSD為1.95%;丁香酚RSD為1.2%，方法重復(fù)性良好。

圖7 梔子苷測(cè)定HPLC圖譜Tab.7 HPLC chromatograms of geniposide

圖8 羥基紅花黃色素A測(cè)定HPLC圖譜Fig.8 HPLC chromatogramsofhydroxysafflor yellow A

圖9 丁香酚測(cè)定HPLC圖譜Fig.9 HPLC chromatograms of eugenol

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的同一批樣品 (批號(hào)20120203，梔子苷含有量為3.881 8 mg/g，羥基紅花黃色素A含有量為3.026 4 mg/g，丁香酚含有量為7.857 0 mg/g)。①低濃度:取約0.25 g精密加入對(duì)照品混合溶液 (含梔子苷0.019 915 mg/mL，羥基紅花黃色素A 0.01056mg/mL，丁香酚0.02380 mg/mL)50 mL;②中濃度:取約0.5 g精密加入對(duì)照品混合溶液 (含梔子苷0.039 83 mg/mL，羥基紅花黃色素 A 0.021 12 mg/mL，丁香酚0.047 60 mg/mL)50 mL;③高濃度:取約1 g精密加入對(duì)照品混合溶液 (含梔子苷0.079 66 mg/mL，羥基紅花黃色素 A 0.042 24 mg/mL，丁香酚0.095 20 mg/mL)50 mL，按供試品溶液同法制備，測(cè)定。結(jié)果梔子苷平均回收率97.24%，RSD為1.2%;羥基紅花黃色素A平均回收率96.75%，RSD為2.0%;丁香酚平均回收率98.56%，RSD為1.8%。見(jiàn)表2～4。

3.10 樣品測(cè)定 按上述測(cè)定方法，測(cè)定11批紅花清肝十三味丸樣品，結(jié)果見(jiàn)表5。

表2 梔子苷加樣回收試驗(yàn)Tab.2 Results of recovety tests of geniposide

表3 羥基紅花黃色素A加樣回收試驗(yàn)Tab.3 Results of recovery tests of hydroxysafflor yellow A

表4 丁香酚加樣回收試驗(yàn)Tab.4 Results of recovery tests of eugenol

4 討論

丁香、丁香酚、木香、去氫木香內(nèi)酯的薄層鑒別中，曾對(duì)木香烴內(nèi)酯薄層色譜進(jìn)行了研究，但在其色譜相應(yīng)位置上，有時(shí)空白會(huì)有干擾，故僅以木香藥材及去氫木香內(nèi)酯作為對(duì)照。

表5 梔子苷、羥基紅花黃色素A、丁香酚測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.5 Determination results of geniposide，hydroxysafflor yellow A，eugenol(n=3)

梔子苷的薄層鑒別中，曾對(duì)梔子對(duì)照藥材薄層色譜進(jìn)行了研究，通過(guò)樣品、梔子苷對(duì)照品、梔子對(duì)照藥材及空白各色譜的比較，認(rèn)為梔子的主要鑒別成分為梔子苷，故僅以梔子苷作為對(duì)照。

丁香中丁香酚的定量測(cè)定采用《中國(guó)藥典》2010年版GC的方法，本研究為達(dá)到在操作簡(jiǎn)便的基礎(chǔ)上得到更多可靠數(shù)據(jù)的目的，采用了HPLC方法測(cè)定丁香酚的量，其最大吸收波長(zhǎng)除參考文獻(xiàn)［10-12］外，還采用了PDA檢測(cè)器掃描驗(yàn)證，確定其最大吸收波長(zhǎng)為280 nm。

本實(shí)驗(yàn)分別采用不同品牌色譜柱Phenomenex luna C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，TechMate C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，Kromasil 100-5C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果羥基紅花黃色素A、丁香酚、梔子苷峰分別在各種色譜柱均分離良好，空白無(wú)干擾，不同色譜柱間測(cè)定羥基紅花黃色素A的RSD為1.2%，丁香酚的RSD為2.3%，梔子苷的RSD為2.3%，表明本HPLC方法有較好的耐用性。

根據(jù)表5的數(shù)據(jù)分析，梔子苷含有量數(shù)據(jù)各廠家、各批次及RSD值差異均較小;羥基紅花黃色素A的含有量測(cè)定數(shù)據(jù)，各廠家之間相差較大，其中廠家C未測(cè)出羥基紅花黃色素A，經(jīng)與企業(yè)聯(lián)系，認(rèn)為與其滅菌方法有關(guān)，該成分不穩(wěn)定，不宜采用加熱滅菌的方法;丁香酚含有量測(cè)定數(shù)據(jù)，各廠家、各批次均有一定差異，由于丁香酚為易揮發(fā)性成分，有可能與原料、生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)有關(guān)。除梔子苷、羥基紅花黃色素A、丁香酚3成分外，還對(duì)沒(méi)食子酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯進(jìn)行了研究。但在與沒(méi)食子酸相應(yīng)保留時(shí)間處訶子陰性對(duì)照有干擾，木香中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰形均欠佳，故未對(duì)這3種成分進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定研究。

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