復(fù)方辣椒堿乳膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馮定軍， 丁捷飛， 胡黎鳳， 俞 偉

(寧波立華制藥有限公司，浙江寧波 315174)

復(fù)方辣椒堿乳膏對急慢性疼痛、腫脹、屈伸不利、麻木僵硬的緩解和治療效果顯著［1］，適用于局部骨骼、關(guān)節(jié)、肌肉、神經(jīng)的非化膿性炎癥狀，如:風(fēng)濕痛、肌肉痛、腰背痛、關(guān)節(jié)炎、肩周炎、急慢性扭傷、腱鞘炎、坐骨神經(jīng)痛等［2-3］。參考文獻［4-9］對復(fù)方辣椒堿乳膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作了研究，采用HPLC法測定辣椒堿、二氫辣椒堿、水楊酸甲酯［10］的量;采用 GC法測定樟腦、薄荷腦的量［11-12］。方法準(zhǔn)確，靈敏，專屬性強，適于作為復(fù)方辣椒堿乳膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀;GC 6890氣相色譜儀。辣椒堿 (批號:108H5852)、二氫辣椒堿(批號:032K7022)對照品購自SIGMA公司。薄荷腦 (批號:110747-200106)、樟腦 (批號:110728-200005)、水楊酸甲酯 (批號:110707-200609)對照品購自中國藥品生物制品檢定所。

色譜級乙腈 (天津四友公司生產(chǎn))，色譜級甲醇 (天津四友公司生產(chǎn))，磷酸 (分析純，天津化學(xué)試劑三廠生產(chǎn))，乙酸乙酯 (分析純，昆山金誠試劑公司生產(chǎn))，重蒸水 (自制)。

樣品為寧波立華制藥有限公司產(chǎn)品技術(shù)部試制。

2 辣椒堿與二氫辣椒堿的測定

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-phenyl(4.6 mm×150mm)色譜柱［13］;以乙腈 －0.1%磷酸溶液 (40∶60)為流動相;檢測波長為280 nm，理論板數(shù)按辣椒堿峰計算應(yīng)不低于4 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取經(jīng)40℃減壓干燥5 h的辣椒堿與二氫辣椒堿對照品適量，加流動相制成每1 mL約含辣椒堿0.045 mg與二氫辣椒堿0.025 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品2.5 g(約相當(dāng)于辣椒堿1.5 mg)，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入乙腈10 mL，置60℃水浴中加熱，振搖使溶解，放涼至室溫，置10℃以下放置12 h，取出迅速濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再置10℃以下放置30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取經(jīng)40℃減壓干燥5 h的辣椒堿對照品9.05 mg與二氫辣椒堿對照品5.15 mg于50 mL量瓶中，加乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60)適量使之溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為181 μg/mL和103 μg/mL的對照品母液。從上述母液中精密吸取5 mL于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，這樣逐級稀釋得5個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖、峰面積值，進行線性回歸。得辣椒堿線性回歸方程為Y=11.917 16×X+14.566 34，相關(guān)系數(shù)為0.999 95;二氫辣椒堿線性回歸方程為Y=11.984 64×X+4.169 66，相關(guān)系數(shù)為0.999 94。由回歸方程知，辣椒堿在11.312 5～181.000 0 μg/mL范圍內(nèi)，二氫辣椒堿在6.437 5～103.000 0 μg/mL范圍內(nèi)峰面積值與樣品質(zhì)量濃度有良好線性關(guān)系。

2.4 干擾試驗 按處方比例及工藝制備不含辣椒堿和二氫辣椒堿的樣品適量，按2.2.3項下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液，取陰性樣品溶液，按2.1項色譜條件進樣，結(jié)果在辣椒堿和二氫辣椒堿峰保留時間處無吸收峰出現(xiàn)。表明樣品中其他成分不干擾測定，方法專屬性強，見圖1。

2.5 精密度試驗 取2.2.1項下辣椒堿和二氫辣椒堿對照品混合液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)重復(fù)進樣5次，觀察峰面積變化的情況。測得辣椒堿峰面積的RSD為0.68%，二氫辣椒堿峰面積的RSD為0.53%。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批號 (20120402)復(fù)方辣椒堿乳膏樣品2.5 g，精密稱定，共6份，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液。測得辣椒堿的RSD為2.0%，二氫辣椒堿為1.3%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品液，分別在0、1、2、3、4、5、6 h進行測定。測得辣椒堿峰面積的RSD為1.4%，二氫辣椒堿峰面積的RSD為1.4%，結(jié)果表明，測試溶液在6 h內(nèi)其主峰面積無明顯變化，本品制備成樣品溶液可以放置6 h測定。

圖1 辣椒堿和二氫辣椒堿對照品 (A)、樣品 (B)及陰性樣品 (C)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

2.8 回收率試驗 取已知含有量的復(fù)方辣椒堿乳膏供試品6份，分別精密加入辣椒堿對照品母液(0.181 mg/mL)和二氫辣椒堿對照品母液 (0.103 mg/mL)5 mL，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按含量測定項下要求，分別吸取上述溶液各20 μL進樣測定，按兩點外標(biāo)法計算，數(shù)據(jù)見表1、表2。

2.9 樣品測定 取對照品溶液和供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣，按兩點外標(biāo)法以峰面積計算辣椒堿和二氫辣椒堿的量。結(jié)果見表3。

表1 辣椒堿加樣回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests of capsicine

表2 二氫辣椒堿加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of dihydrocapsaicin

表3 樣品中辣椒堿和二氫辣椒堿測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Results of determination of capsicine and dihydrocapsaicin in samples(n=3)

3 水楊酸甲酯的測定

3.1 色譜條件選擇 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱 (150 mm×4.6 mm);以甲醇-水(80∶20)為流動相;檢測波長為300 nm，體積流量為1.0 mL/min。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取水楊酸甲酯對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品0.3 g，加甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

3.2.3 空白對照溶液的制備 按處方比例及工藝制備方法，不加冬青油同法制備，得復(fù)方辣椒堿乳膏的冬青油空白樣品。將空白同供試品溶液的制備方法制得空白對照溶液。

3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取水楊酸甲酯對照品4.92 mg于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為98.4 μg/mL對照品母液。從上述母液中精密吸取5 mL于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，這樣逐級稀釋得5個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖、峰面積值，并以質(zhì)量濃度為X，峰面積為Y，進行線性回歸。測得線性回歸方程為Y=22.268 74×X+2.891 43，相關(guān)系數(shù)為1.000 0。由回歸方程知，水楊酸甲酯在12.30～196.80 μg/mL范圍內(nèi)峰面積值與樣品質(zhì)量濃度有良好線性關(guān)系。

3.4 精密度試驗 取3.2項下配置的水楊酸甲酯對照品，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)重復(fù)進樣5次，觀察峰面積變化的情況。測得水楊酸甲酯峰面積的RSD為0.44%。

3.5 重復(fù)性試驗 取同一批號 (20120402)復(fù)方辣椒堿乳膏樣品0.3 g，精密稱定，共6份，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液。取3.2項下配置的水楊酸甲酯對照品，精密吸取20 μL，按測定項下要求測定，考察本測定方法的重復(fù)性。結(jié)果測得水楊酸甲酯的RSD為0.69%。

3.6 溶液穩(wěn)定性試驗 取同一批號 (20120402)本品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品液，按測定項下要求，分別在0、1、2、3、4、5、6 h進行測定。測得水楊酸甲酯峰面積的RSD為1.45%。

試驗結(jié)果表明，測試溶液在6 h內(nèi)其主峰面積無明顯變化，本品制備成樣品溶液可以放置6h測定。

3.7 專屬性試驗 按空白樣品溶液配制方法制備樣品，精密吸取空白樣品溶液20 μL，進樣，檢測。結(jié)果陰性無干擾，本方法專屬性良好，見圖2。

圖2 水楊酸甲酯對照品 (A)、樣品 (B)及陰性樣品 (C)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of methyl salicylate(A)，sample(B)and negative sample(C)

3.8 準(zhǔn)確度試驗 取已知含有量的復(fù)方辣椒堿乳膏供試品 (批號為20120401)6份，精密稱定，分別精密加入水楊酸甲酯對照品母液 (0.049 2 mg/mL)5.0 mL，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按測定項下要求，吸取上述溶液20 μL進樣測定，按兩點外標(biāo)法計算，考察本測定方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果見表4。

表4 水楊酸甲酯加樣回收率試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests of methyl salicylate

由表4可知，水楊酸甲酯加樣回收率在95%～105%范圍內(nèi)，符合要求。試驗結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度良好。

3.9 樣品測定 本品3批復(fù)方辣椒堿乳膏按3.1項下色譜條件及3.2項下溶液制備方法制備供試品溶液，按兩點外標(biāo)法以峰面積計算，結(jié)果見表5。

表5 樣品中水楊酸甲酯測定結(jié)果(n=3)Tab.5 Results of determination of methyl salicylate in samples(n=3)

4 樟腦，薄荷腦的測定

4.1 色譜條件 聚乙二醇20 M毛細(xì)管色譜柱;氫火焰離子檢測器;柱溫100℃;檢測器溫度220℃;分流進樣方式。

4.2 前處理方法的選擇 取裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，精密稱取本品4 g(相當(dāng)于樟腦，薄荷腦各約60 mg)，置500 mL燒瓶中，加水200 mL，連接揮發(fā)油測定器。自測定器上端加水使充滿刻度，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯4 mL，連接回流冷凝管，加熱回流3 h，靜置冷卻后，將乙酸乙酯放置具塞錐形瓶中，用乙酸乙酯適量多次沖洗冷凝管及揮發(fā)油測定器，合并乙酸乙酯液，加無水硫酸鈉適量，振搖，濾過置50 mL量瓶中，用適量乙酸乙酯洗滌錐形瓶，洗液濾入濾液中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

4.3 線性關(guān)系考察 精密稱取樟腦對照品47.27 mg與薄荷腦對照品45.39 mg于10 mL量瓶中，加乙酸乙酯適量使之溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為4.727 mg/mL和4.539 mg/mL的對照品母液。從上述母液中精密吸取5 mL于10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，這樣逐級稀釋得5個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別取1 μL進樣，記錄色譜圖、峰面積值，并以質(zhì)量濃度為X軸，峰面積為Y軸，進行線性回歸。測得樟腦線性回歸方程為Y=1 187.656 45X+0.118 276，相關(guān)系數(shù)為0.999 95;薄荷腦線性回歸方程為Y=1 195.294 94X+1.439 70，相關(guān)系數(shù)為0.999 95。

由回歸方程知，樟腦在0.295 4～4.727 mg/mL范圍內(nèi)，薄荷腦在0.283 7～4.539 mg/mL范圍內(nèi)峰面積值與樣品質(zhì)量濃度有良好線性關(guān)系。

4.4 精密度試驗 取樟腦和薄荷腦對照品，精密稱定，加乙酸乙酯溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含樟腦1.2 mg與薄荷腦1.2 mg的混合溶液，作為供試品溶液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)重復(fù)進樣5次，觀察峰面積變化的情況。測得樟腦峰面積的RSD為0.95%，薄荷腦峰面積的RSD為0.93%。試驗結(jié)果表明，本儀器精密度良好。

4.5 重復(fù)性試驗 取同一批號 (20120402)復(fù)方辣椒堿乳膏樣品4 g，精密稱定，共6份，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液。另取4.4項下配置的樟腦和薄荷腦對照品溶液，精密吸取1 μL，按測定項下要求測定，考察本測定方法的重復(fù)性。結(jié)果測得樟腦的RSD為0.47%，薄荷腦的RSD為0.91%。結(jié)果表明本試驗方法重復(fù)性良好。

4.6 溶液穩(wěn)定性試驗 取同一批號 (20120402)本品，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品液，按測定項下要求，分別在0、1、2、3、4、5、6 h進行測定。結(jié)果測得樟腦峰面積的RSD為1.61%，薄荷腦峰面積的RSD為1.72%。

試驗結(jié)果表明，測試溶液在6 h內(nèi)其主峰面積無明顯變化，本品制備成樣品溶液可以放置6 h測定。

4.7 專屬性試驗 按空白樣品溶液配制方法制備樣品，精密吸取陰性樣品溶液20 μL，進樣，檢測。結(jié)果陰性無干擾，本方法專屬性良好，見圖3。

圖3 對照品 (A)、樣品 (B)及陰性 (C)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

4.8 準(zhǔn)確度試驗 取已知含有量的復(fù)方辣椒堿乳膏 (批號為20120402)供試品6份，精密稱定，分別精密加入樟腦對照品母液 (10.25 mg/mL)和薄荷腦對照品母液 (10.028 mg/mL)5.0 mL，同供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按測定項下要求，吸取1 μL進樣測定，按兩點外標(biāo)法計算，考察本測定方法的準(zhǔn)確度。

表6 樟腦加樣回收率試驗結(jié)果Tab.6 Results of recovery tests of camphor

表7 薄荷腦加樣回收率試驗結(jié)果Tab.7 Results of recovery tests of menthol

由上兩表可知，樟腦和薄荷腦加樣回收率在95%～105%范圍內(nèi)，符合要求。試驗結(jié)果表明，本試驗方法的準(zhǔn)確度良好。

4.9 樣品測定 精密稱取樟腦與薄荷腦對照品適量，加乙酸乙酯制成每1 mL約含樟腦1.2 mg與薄荷腦1.2 mg的混合溶液，作為對照品溶液;取裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，按4.2項下前處理方法處理3批樣品，得供試品溶液。按4.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，按兩點外標(biāo)法以峰面積計算，即得。測定結(jié)果見表8。

表8 樣品中樟腦和薄荷腦測定結(jié)果(n=3)Tab.8 Results of determination of camphor and menthol in samples(n=3)

5 討論

5.1 檢測波長的選擇 通過紫外可見分光光度計全波長掃描，發(fā)現(xiàn)辣椒堿和二氫辣椒堿在可見光區(qū)都無較大吸收，當(dāng)波長為280 nm時，測定組分有較大吸收，因此本實驗選擇280 nm為辣椒堿和二氫辣椒堿的吸收波長。

5.2 流動相的選擇 參照國家標(biāo)準(zhǔn) (試行) “辣椒堿軟膏” (標(biāo)準(zhǔn)號:WS-1023(X-763)-2002)中檢測辣椒堿和二氫辣椒堿的色譜方法，選擇乙腈－0.1%磷酸溶液 (33∶67)為流動相。為了方便研究將流動相比例作了適當(dāng)調(diào)整。因為當(dāng)體積流量為1.0 mL/min，乙腈 －0.1%磷酸溶液 (33∶67)時，樣品出峰需要30 min左右，出峰時間較長;若改為乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60)則出峰時間在20 min內(nèi)，時間上比較合理，且又不影響各組分峰形及分離度。由此選擇乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60)為流動相。

5.3 柱溫的選擇 高效液相色譜分析中，柱溫是影響分離度及分析時間的因素之一［14］。一般情況下，溫度升高，可使流動相的黏度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高對分離選擇性有一定的影響，且使流動相易產(chǎn)生氣泡。實驗表明，隨著柱溫的升高，組分保留時間變短。隨溫度變化后兩個組分間的分離度都遠(yuǎn)大于1.5，保留時間差足夠大，不影響分離度。但在30℃下二氫辣椒堿保留時間較長，但柱溫過高，對色譜柱的壽命有影響，因此實驗選擇40℃的柱溫。

［1］毛 慶，張小松，何 華.反相高效液相色譜法測定辣椒風(fēng)濕軟膏中總辣椒堿含量［J］.中國藥業(yè)，2006，16(8):36.

［2］龍曉英，羅佳波，李立任，等.局部用辣椒堿傳遞體的制備及體外評價［J］.中國中藥雜志，2006，31(12):981.

［3］周雯雯，李湘洲，顏賢仔.辣椒堿的提取精制和應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2007，41(3):56-58.

［4］谷 巖，劉廣福，黃 旭，等.高效液相法測定辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿［J］.化學(xué)分析計量，2011，20(6):74-76.

［5］賈曉斌，劉 齊，韋英杰，等.RP-HPLC雙波長同時測定關(guān)節(jié)止痛膏中硫酸阿托品、鹽酸苯海拉明、辣椒堿和二氫辣椒堿的含量［J］.中國中藥雜志，2010，350(21):2840-2841.

［6］李 堅，龍曉英，孫 娟，等.HPLC法測定不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17(3):202-203.

［7］楊雅婷，李天俊，叢方地，等.辣椒堿制備及測定方法的研究進展［J］.行業(yè)綜述，2008，20(6):14-18.

［8］潘永峰，盧玉斌，鄔芙蓉，等.HPLC法測定辣椒中辣椒素的含量［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7(5):47-48.

［9］段思怡，黃毅嵐，張 丹.HPLC測定辣椒風(fēng)濕貼中辣椒堿的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22(1):106-107.

［10］宋 心，林桂濤，盛華剛，等.HPLC法測定傷痛寧巴布膏中的有效成分［J］.山東中醫(yī)雜志，2011，30(11):812-814.

［11］周利賢，吳陳軍.氣相色譜法測定復(fù)方薄荷腦鼻滴液中樟腦及薄荷腦的含量［J］.中國藥師，2004，7(6):430-431.

［12］何 強.氣相色譜法測定皮炎平軟膏中樟腦、薄荷腦的含量［J］.廣東藥學(xué)，2003，13(6):13-14.

［13］WS-1022-(X-762)-2002，國家藥品監(jiān)督管理局單頁標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［14］趙軼男.高效液相色譜技術(shù) (HPLC)影響因素的選擇［J］.分析試驗室，2007，26(S1):340-341.