雙波長(zhǎng)RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定婦科十味片中芍藥苷、阿魏酸

劉亞蓉， 宋 霞， 劉海青

(青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧 810016)

婦科十味片源于明·張時(shí)徹所撰《攝生眾妙方》卷十一之“四制香附丸”，系在“四制香附丸”基礎(chǔ)上加減化裁而來。由香附 (醋炙)、當(dāng)歸、熟地黃、川芎、延胡索 (醋炙)、白術(shù)、赤芍、白芍、大棗、甘草、碳酸鈣組成。現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2010年版。主要功效養(yǎng)血舒肝，調(diào)經(jīng)止痛［1］?！吨袊?guó)藥典》中以芍藥苷為指標(biāo)對(duì)白芍、赤芍進(jìn)行了定量控制，有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)婦科十味片中當(dāng)歸、川芎進(jìn)行阿魏酸的定量測(cè)定［2-5］。本方法在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定芍藥苷、阿魏酸兩個(gè)組分，芍藥苷測(cè)定值與《中國(guó)藥典》方法芍藥苷測(cè)定結(jié)果一致。該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能同時(shí)控制婦科十味片處方中四味藥材的兩個(gè)組分，能更好地控制該藥品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜色譜儀，2487二極管陣列檢測(cè)器;Milli-QA超純水器 (Millipore)。

1.2 試藥 芍藥苷對(duì)照品 (批號(hào)110736-201035，純度96.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，阿魏酸對(duì)照品 (批號(hào)110773-200611，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。婦科十味片 (收集到5家生產(chǎn)企業(yè)共10批樣品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Sunfire C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm(芍藥苷)，310 nm(阿魏酸)。

表1 梯度洗脫時(shí)間Tab.1 Mobile phase in gradient elution mode

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷對(duì)照品(110736-201035，純度 96.5%)12.12 mg，置 20 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含芍藥苷0.585 mg的對(duì)照品溶液;另精密稱取阿魏酸對(duì)照品4.89 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL中含阿魏酸0.097 8 mg的對(duì)照品溶液。分別精密兩種對(duì)照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，得含芍藥苷58.5 μg/mL，阿魏酸9.78 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品制備 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按婦科十味片處方及工藝，分別制備缺“白芍、赤芍”和缺“當(dāng)歸、川芎”的陰性樣品，并按照2.2.2項(xiàng)下方法分別制備兩種陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、芍藥苷對(duì)照品溶液、阿魏酸對(duì)照品溶液、缺“白芍、赤芍”和缺“當(dāng)歸、川芎”的陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果，在供試品溶液色譜圖中，分別有與芍藥苷和阿魏酸保留時(shí)間一致的特征峰，且紫外光譜圖與芍藥苷、阿魏酸對(duì)照品光譜圖一致。陰性樣品無此特征峰，表明陰性樣品對(duì)所測(cè)組分無干擾。見圖1、圖2。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述芍藥苷、阿魏酸混合對(duì)照品溶液 2、4、8、12、16、20 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為芍藥苷Y=532 042X－109.6，r=0.999 9;阿魏酸Y=403 162X+348.3，r=0.999 9。結(jié)果表明:芍藥苷在0.117 ～1.170 μg;阿魏酸在 0.0196 ～0.196 μg的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜圖，結(jié)果芍藥苷、阿魏酸峰面積RSD分別為1.5%、1.3%。

圖1 HPLC色譜圖 (檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm)Fig.1 HPLC chromatograms(detection wavelength 230 nm)

圖2 HPLC色譜圖 (檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm)Fig.2 HPLC chromatograms(detection wavelength 310 nm)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批婦科十味片 (批號(hào)1123034)的供試品溶液，在2.2.1項(xiàng)下色譜條件下分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果芍藥苷、阿魏酸峰面積RSD分別為1.8%、1.1%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批婦科十味片(批號(hào)1123034)樣品6份，分別按2.2.2項(xiàng)制備成供試品溶液，在2.2.1項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果樣品中芍藥苷、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.23、0.082 mg/g，RSD分別為1.7%、1.6%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含有量的婦科十味片樣品 (批號(hào)1123034，芍藥苷、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.23、0.082 mg/g)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，稱取9份，分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液 (0.585 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL各3份，阿魏酸對(duì)照品溶液 (0.097 8 mg/mL)0.4、0.5、0.6 mL各3份，按2.2.2項(xiàng)制備成供試品溶液，在2.2.1項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，并按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷、阿魏酸的量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明回收率良好，見表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

2.9 樣品測(cè)定 采用上述方法測(cè)定來自5家企業(yè)的10批樣品，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=4)Tab.3 Determination results of samples(n=4)

3 討論

由于芍藥苷和阿魏酸性質(zhì)差異較大，為了能使2種組分分離，參照文獻(xiàn)以不同比例的甲醇 －0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸、乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行了考察［6-8］，結(jié)果等梯度情況下得不到很好的分離，因此最終確定表1中梯度洗脫，在該洗脫條件下2種組分得到了較好的分離。且采用Zorbax?Extend C18柱、Hypersil ODS2柱進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果均獲得較好的分離。

試驗(yàn)中根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器所得紫外吸收光譜圖，芍藥苷的最大吸收波長(zhǎng)為232 nm，阿魏酸的最大吸收波長(zhǎng)為323 nm，二者難以在同一波長(zhǎng)處測(cè)定，因此參照相關(guān)文獻(xiàn)采用雙波長(zhǎng)切換法［9-12］，分別選擇2個(gè)組分各自的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

按照《中國(guó)藥典》2010年版一部“婦科十味片”【含量測(cè)定】項(xiàng)下方法對(duì)10批樣品芍藥苷進(jìn)行了測(cè)定，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于原標(biāo)準(zhǔn)中已有的定量指標(biāo)芍藥苷，各生產(chǎn)企業(yè)間及企業(yè)不同批次間較為穩(wěn)定、均一。而標(biāo)準(zhǔn)中未控制的定量指標(biāo)，各企業(yè)間差異較大。本方法同時(shí)測(cè)定婦科十味片中芍藥苷、阿魏酸的量，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為更好的控制其內(nèi)在質(zhì)量提供了依據(jù)。

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