HPLC法測(cè)定鎮(zhèn)痛口服液中2種生物堿類成分

張 浩， 張 慶

(湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢 430064)

鎮(zhèn)痛口服液處方由洋金花、制草烏、鬧羊花、細(xì)辛、姜黃五味藥組成，具有活血通絡(luò)、散寒止痛的功效，用于血栓閉塞性脈管炎、肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤屬寒凝淤滯所致的疼痛。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥監(jiān)局注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)WS3-734(Z-138)-2005(Z)，用TLC-SCAN法測(cè)定東莨菪堿的量，方法精密度、準(zhǔn)確度均較差，無(wú)法很好控制產(chǎn)品質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定洋金花中主要生物堿類成分的量，方法準(zhǔn)確，可控性更強(qiáng)。

1 儀器與試藥

Waters e2695-2489高效液相色譜儀、DIONEX U3000高效液相色譜儀、DIONEX P680高效液相色譜儀;Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱;AG135型電子天平;MS204S/Z型電子天平。氫溴酸東莨菪堿 (批號(hào)100049-200308供定量測(cè)定用)、硫酸阿托品 (批號(hào)100040-200510供定量測(cè)定用)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈、庚烷磺酸鈉為色譜純;甲醇、乙酸鈉、冰醋酸為分析純;水為重蒸水。鎮(zhèn)痛口服液由李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供，批號(hào):201109001、201109002、201109003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考《中國(guó)藥典》2010年版一部洋金花藥材含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件［1］，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，選擇相應(yīng)離子對(duì)試劑，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果以乙腈－0.05 mol/L乙酸鈉 (含0.012 5 mol/L庚烷磺酸鈉，用冰醋酸調(diào)pH至6.0)(20∶80)為最佳流動(dòng)相。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 針對(duì)生物堿類成分進(jìn)行提取純化。精密量取本品50 mL，置分液漏斗中，加稀鹽酸調(diào)pH值至1～2，搖勻，加三氯甲烷振搖提取3次，每次30 mL，棄去三氯甲烷層，分取酸水層，加氨試液調(diào)節(jié)pH值9～10，搖勻，加三氯甲烷提取5次，每次30 mL，合并三氯甲烷層，揮干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取兩種對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含氫溴酸東莨菪堿0.35 mg(折算成東莨菪堿為0.24 mg)、硫酸阿托品90 μg的溶液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中缺洋金花的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別依法測(cè)定，同時(shí)測(cè)定相應(yīng)時(shí)間的DAD光譜圖，在該色譜條件下，在與氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品保留時(shí)間相同的位置不出現(xiàn)色譜峰，表明其他成分對(duì)兩者測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液 (A)供試品溶液 (B)與陰性對(duì)照溶液 (C)色譜圖Fig.1 HPLC chromotographs of reference substance(A)，sample(B)and solution without scopolamine hydrobromide and atropine sulfate(C)

2.3.2 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液，氫溴酸東莨菪堿為0.498 6 mg/mL、硫酸阿托品為0.096 8 mg/mL，分別進(jìn)樣 1、2、5、10、20 μL，以測(cè)得峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，氫溴酸東莨菪堿的進(jìn)樣量在0.498 6～9.297 2μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，Y=16 122.6+678 293.7X(r=0.999 9);硫酸阿托品的進(jìn)樣量在0.096 8～1.936 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，Y=33 533.4+826 748.0X(r=0.999 7)。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取二者混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的峰面積計(jì)算RSD(n=6)，分別為0.75%、0.89%。結(jié)果表明，儀器精密度符合要求。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)201109001)適量，共6份，照2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，東莨菪堿質(zhì)量濃度為20.29 μg/mL，RSD(n=6)為2.36%、硫酸阿托品質(zhì)量濃度為6.91 μg/mL，RSD(n=6)為2.23%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率法。分別精密量取已知含有量的樣品25 mL(批號(hào)201109001，東莨菪堿質(zhì)量濃度為20.29 μg/mL、硫酸阿托品質(zhì)量濃度為6.91 μg/mL)，共6份，精密加入氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品1 mL(0.464 4 mg/mL，折算成東莨菪堿為0.321 4 mg/mL)及硫酸阿托品對(duì)照品1 mL(0.242 4 mg/mL)，按2.2.1項(xiàng)操作，測(cè)定并計(jì)算供試品中東莨菪堿、硫酸阿托品的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)本法回收率較好。

表1 氫溴酸東莨菪堿與硫酸阿托品回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recoveries for scopolamine hydrobromide and atropine sulfate

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液 (批號(hào)201109001)分別于0、2、4、6、8、10 h內(nèi)進(jìn)行分析，進(jìn)樣量10 μL，氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品峰面積的RSD(n=6)分別為1.77%、1.92%。結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定良好，可滿足檢測(cè)時(shí)間的需要。

2.3.7 不同色譜柱耐用性 精密稱取同一批號(hào)(批號(hào)201109001)的樣品，按2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，采用DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱在上述色譜條件下進(jìn)行分析。以氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的峰面積計(jì)算RSD(n=6)，分別為0.38%、0.56%。結(jié)果表明，3種色譜柱測(cè)定結(jié)果精密度良好。

2.4 樣品測(cè)定

用HPLC法測(cè)定兩種生物堿，并與原標(biāo)準(zhǔn)采用TLC-SCAN法測(cè)定氫溴酸東莨菪堿進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (μg·mL－1)Tab.2 Results of determination by HPLC and TLC scan(μg·mL－1)

3 討論

，氫溴酸東莨菪堿的HPLC流動(dòng)相，有甲醇-水［2-3］(40∶60，水中含0.02 mol/L 醋酸鈉、0.02%三乙胺、用冰醋酸調(diào)pH至6.0)、甲醇-水［4］(含 0.025 mol/L庚烷磺酸鈉及 0.05 mol/L醋酸鈉，以醋酸調(diào)pH=4.6)(45∶55)、甲醇-水［5］(53 ∶47，水中含 20 mmol/L 醋酸鈉，0.02%三乙胺，0.3%四氫呋喃，pH為6.86)等，多所選緩沖鹽［6］或離子對(duì)系統(tǒng)［7-10］，且對(duì)pH均有控制。尚有采用GC法進(jìn)行測(cè)定［11］。本實(shí)驗(yàn)所用流動(dòng)相系統(tǒng)，所用醋酸鹽及庚烷磺酸鈉，比《中國(guó)藥典》2010年版洋金花測(cè)定項(xiàng)下磷酸鹽及十二烷基硫酸鈉，更有利于保護(hù)色譜柱，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳離子對(duì)試劑濃度與適宜pH值。

原標(biāo)準(zhǔn)TLC-SCAN法僅測(cè)定氫溴酸東莨菪堿，結(jié)果與HPLC法相比相差近30%，且TLC-SCAN法操作過(guò)程誤差較大，斑點(diǎn)顯色后不穩(wěn)定，易褪色，測(cè)定波長(zhǎng)選擇不合適，故無(wú)法控制該產(chǎn)品質(zhì)量。HPLC法可同時(shí)測(cè)定該制劑中兩種生物堿類成分的量，方法靈敏準(zhǔn)確，可控制性強(qiáng)，完全可替代TLC-SCAN法用于控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

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