川黃連中小檗堿的提取及純化工藝的研究

林葉新， 夏之寧，*， 陳 華， 楊豐慶

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030;2.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400030)

黃連為毛莨科植物黃連Coptis chinensisFranch的干燥根莖［1］。小檗堿為黃連中含有量最高的原小檗堿型生物堿，也是最重要的活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗癌，治療糖尿病和心血管疾病，及抑制脂肪分化等多方面藥理作用［2－6］。

傳統(tǒng)用于提取黃連小檗堿的方法有稀硫酸法、乙醇浸提法、水提法等［7－9］，這些方法有一定的局限性，如消耗溶劑量大、耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低等。因此，為提高黃連小檗堿的提取率，一些現(xiàn)代化方法，如有超聲波提取法、超微振動(dòng)法、亞臨界水提取法、加速溶劑萃取法、微波－索氏工藝聯(lián)合提取法等［10－13］也被采用于黃連小檗堿的提取中。尤其是微波輔助提取，因微波具有能促進(jìn)植物細(xì)胞破裂，提高有效成分從物料內(nèi)部向提取溶劑界面的擴(kuò)散速率，減少提取溶劑的使用量［14］等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物提取中得到廣泛的應(yīng)用。

雖然已有采用微波輔助提取黃連中的生物堿的報(bào)道，但在微波提取工藝中，因微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易引起爆沸現(xiàn)象，通常只能采取間歇式微波提取［15］。所以常規(guī)的微波輔助提取，一般有兩種:直接采用微波提取的方式［15］;或是先用微波處理樣品，提高物料的擴(kuò)散率，再用其他方法 (如索氏抽提)提取目標(biāo)物［16］。這類(lèi)微波提取方式，耗時(shí)長(zhǎng)、操作步驟繁瑣。

本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助回流法提取，對(duì)黃連中的小檗堿進(jìn)行提取，并通過(guò)單因素及正交設(shè)計(jì)法確定提取的最佳工藝。研究中采用的TCMC—204型溫控式微波化學(xué)反應(yīng)器是可控溫式的，能有效避免爆沸現(xiàn)象，并降低了高溫破壞目標(biāo)產(chǎn)物的可能性。通過(guò)與傳統(tǒng)提取工藝的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)此方法提取時(shí)間短，提取率高，優(yōu)于其他提取方式。此外，本研究還采用了AB－8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃連生物堿進(jìn)行分離純化。通過(guò)比較小檗堿的提取率和純化后的純度，得到一種快速簡(jiǎn)單有效地提取及純化川黃連中小檗堿的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 川黃連購(gòu)買(mǎi)于重慶康濟(jì)躍洪藥業(yè)有限公司。將黃連粉碎，過(guò)50目篩。鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 (純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)、乙腈 (分析純，上海陸都試劑化工廠)、冰醋酸(分析純，重慶川東化工有限公司)、無(wú)水乙醇(分析純，重慶川東化工有限公司)、AB－8大孔樹(shù)脂 (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2 儀器 TCMC—204型溫控式微波化學(xué)反應(yīng)器(南京陵江科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司)、LC—900B高效液相色譜儀 (配LB 900型紫外檢測(cè)器，重慶川儀九廠)、HW—2000色譜工作站 (南京千譜軟件有限公司)、SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、UV—2450紫外分光光度計(jì) (日本島津公司)、AY120電子天平 (日本島津公司)

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫25℃;流動(dòng)相為乙腈－水 (30∶70)含0.6% 冰醋酸，體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)342 nm。

1.3.2 對(duì)照品工作曲線的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜流動(dòng)相溶解成0.025 mg/mL的鹽酸小檗堿母液，備用。使用時(shí)，用色譜流動(dòng)相逐級(jí)稀釋至所需的質(zhì)量濃度。用 RPHPLC測(cè)定鹽酸小檗堿的量，每個(gè)樣品測(cè)定3次。以鹽酸小檗堿峰面積對(duì)質(zhì)量濃度擬合工作曲線。

1.3.3 微波輔助回流法提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取川黃連藥粉 (3.0 g)，在設(shè)定條件下，采用TCMC—204型溫控式微波化學(xué)反應(yīng)器，對(duì)黃連小檗堿進(jìn)行提取。提取工藝優(yōu)化時(shí)，先通過(guò)單因素試驗(yàn) (考察乙醇濃度、微波回流時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)等因素)選取影響黃連小檗堿提取率的因素和水平，再進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。提取率計(jì)算公式為 (提取所得小檗堿的質(zhì)量/生藥質(zhì)量)×100%。單因素初始條件為乙醇40%，微波時(shí)間10 min，溫度為70℃，料液比為1∶20，提取次數(shù)為1次。

1.3.4 回流提取及水浴加熱提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取黃連藥粉 (3.0 g)，進(jìn)行回流提取和水浴加熱提取1 h，各進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。其他提取條件與通過(guò)正交試驗(yàn)獲得的微波輔助回流提取條件如溫度、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)等保持一致。測(cè)定提取液中小檗堿的量，計(jì)算提取率。

1.3.5 AB－8大孔樹(shù)脂純化工藝 (1)大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理:將大孔吸附樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，再用乙醇洗至溶液加適量蒸餾水無(wú)白色渾濁現(xiàn)象時(shí)為止，最后用蒸餾水洗至無(wú)醇味，備用。(2)最大上樣量的考察:AB－8樹(shù)脂濕法裝柱，將微波輔助回流法提取得到的樣品濃縮至小檗堿質(zhì)量濃度為2.9 mg/mL，之后把濃縮液100 mL緩慢加入裝有10 mL濕AB－8的樹(shù)脂的玻璃柱中，控制體積流量為1.0 mL/min，每樹(shù)脂床體積(Bed volume，BV)即10 mL收集1個(gè)流分，并用RP－HPLC法測(cè)定每1 BV中小檗堿的量。根據(jù)每1 BV中小檗堿的量確定最大上樣量。(3)水洗脫用量的考察:將已吸附好黃連提取液的AB－8樹(shù)脂，用蒸餾水洗脫雜質(zhì)，洗脫液體積流量為1.0 mL/min。每1 BV收集一次，測(cè)定小檗堿泄漏情況。(4)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的考察:根據(jù)確定的最大上樣量上樣，將吸附好黃連提取液的大孔樹(shù)脂，用適量蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再分別用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液作為洗脫液，洗脫液體積流量為1.0 mL/min，洗脫5 BV，并收集好。測(cè)定5 BV流分中小檗堿的總量。 (5)洗脫劑用量的考察:按 (3)和 (4)項(xiàng)所得的蒸餾水洗脫劑用量和乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)，洗脫已吸附好黃連提取液的AB－8樹(shù)脂，洗脫液體積流量為1.0 mL/min。每1 BV為一個(gè)考察單位，至洗脫液近無(wú)色，分別測(cè)定各BV洗脫液中小檗堿的量。(6)純化試驗(yàn)及小檗堿回收率:取一定量的黃連提取濃縮液按最佳純化條件進(jìn)行吸附和洗脫，將洗脫液和上樣前濃縮液分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至黏稠狀，移置真空干燥箱干燥，測(cè)定純化前后提取物中小檗堿的量，并計(jì)算純度及小檗堿回收率。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿定量測(cè)定

2.1.1 RP－HPLC色譜條件 在選定的1.3.1項(xiàng)的色譜條件下，川黃連提取物中目標(biāo)物小檗堿的峰與其他成分可實(shí)現(xiàn)基線分離。小檗堿色譜峰的tR值為8.6 min，見(jiàn)圖1。

圖1 川黃連微波輔助回流提取液 (A)與鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 (B)的RP-HPLC譜圖對(duì)照Fig.1 RP-HPLC chromatograms of Coptis chinensis Franch from Sichuan Province extracts using microwave assisted reflux extraction(A)and berberine hydrochloride standard(B)

2.1.2 RP－HPLC外標(biāo)法繪制小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線將小檗堿母液用流動(dòng)相稀釋成 12.50、6.25、3.125、1.562、0.781和0.391 μg/mL 6個(gè)質(zhì)量濃度，分別進(jìn)行RP－HPLC分析，在0.391～12.50 μg/mL范圍內(nèi)，小檗堿的量與其峰面積具有良好的線性關(guān)系Y=48 965X+6 396， (R2=0.999 3，n=6)，小檗堿質(zhì)量濃度與其峰面積具有良好的線性關(guān)系。檢測(cè)限 (3 δ)為0.038 μg/mL，定量限(10 δ)為 0.169 μg/mL。

2.2 微波輔助回流法提取工藝

2.2.1 單因素試驗(yàn) 依次考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波回流時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)等因素對(duì)川黃連中小檗堿提取率的影響。見(jiàn)圖2。

圖2 單因素試驗(yàn)Fig.2 Single factor experiment

通過(guò)與圖1、2的結(jié)果比較來(lái)看，提取次數(shù)對(duì)提取率的影響并不是很大，考慮節(jié)約溶劑和能源的因素，將選擇提取次數(shù)為2次，并不作為提取工藝的必要條件，加入到正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中。因此，最終確定正交試驗(yàn)的所選的因素水平為時(shí)間 (10 min、20 min和30 min)、溫度 (60℃、70℃和80℃)、乙醇 (50%、60%和70%)，料液比 (1∶15、1∶20和1∶25)，提取次數(shù)為2次。

2.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，直接設(shè)定提取次數(shù)2次。并選取微波時(shí)間 (A)、提取溫度 (B)、乙醇體積分?jǐn)?shù) (C)、料液比 (D)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9(34)正交表，以小檗堿的量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察以上4個(gè)因素對(duì)川黃連中小檗堿提取工藝的影響。因素水平見(jiàn)表1，并通過(guò)軟件正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ3.1設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

由R值可知，各因素對(duì)提取率的影響大小為B＞A＞C＞D，即溫度對(duì)小檗堿提取率的影響最大，其次是時(shí)間、乙醇濃度和料液比，通過(guò)k值可判斷出最佳提取條件是A1B3C1D3，即微波回流10 min，提取溫度80℃，50%乙醇，料液比1∶25，提取次數(shù)2次。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of orthogonal test L9(34)

2.2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 在優(yōu)化的微波輔助回流提取條件下，加標(biāo)樣回收率在98.8% ～101.7%之間，平均加標(biāo)回收率為100.2%，RSD為1.5%(n=3)，表明已優(yōu)化的微波回流提取方法有較好的提取率及重復(fù)性。

2.3 與傳統(tǒng)提取方法的比較

為更好的與傳統(tǒng)提取方法相比較，3種提取方法中，除提取時(shí)間不同外 (微波回流提取法為10 min;單純回流法及水浴加熱法為1 h)，所使用的提取溶劑的濃度、料液比、溫度及提取次數(shù)均與微波輔助回流提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最優(yōu)條件一致(提取溫度80℃，50%乙醇，料液比1∶25，提取2次)。每種方法，均重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在其它提取條件都相同的情況下，微波輔助回流法提取時(shí)間僅為10 min時(shí)，提取率為8.5%，比單純的回流1 h或水浴加熱1 h對(duì)小檗堿的提取率都要高。這3種方法中，提取率最低的為水浴加熱，僅為5.5%;而單純回流法，提取率為6.2%。

2.4 小檗堿的純化工藝

2.4.1 最大上樣量的考察 按1.3.5項(xiàng) (2)收集流分并測(cè)定每1 BV中小檗堿的量 (圖3)。從第4 BV開(kāi)始，小檗堿泄漏量高于1 mg，而到5 BV時(shí)，小檗堿檢出量明顯增多?？紤]到生產(chǎn)工藝中要避免并盡量減少小檗堿的泄漏，確定最大上樣體積為3 BV的川黃連提取液 (小檗堿質(zhì)量濃度為2.9 mg/mL)，即最大上樣量為8.7 mg小檗堿/mL樹(shù)脂(濕體積)。

圖3 小檗堿泄露曲線Fig.3 Curve of berberine leakage

2.4.2 水洗脫劑用量的考察 用水洗脫的目的是除去提取液中的雜質(zhì)，提高小檗堿的純度。按1.3.5項(xiàng) (3)的方法收集流分，并測(cè)定小檗堿的量。結(jié)果如圖4所示，隨著水洗次數(shù)的增加，已吸附好的小檗堿亦部分被洗下，造成其損失量也增大，當(dāng)水洗脫量達(dá)4 BV時(shí)，小檗堿損失率高于0.2 mg。雖然水洗脫量為3 BV時(shí)，已有部分小檗堿被洗脫下來(lái)，但接收流分期間，觀察到在第3 BV時(shí)，所獲得的溶液與第1和第2 BV一樣有輕微渾濁狀，說(shuō)明其中仍存在少量的雜質(zhì)。因此，為更好的洗脫雜質(zhì)，提高小檗堿的純度，并減少小檗堿的損失量，選擇3 BV為洗脫雜質(zhì)用水量。

圖4 小檗堿泄露曲線Fig.4 Curve of berberine leakage

2.4.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的考察 按1.3.5項(xiàng) (4)的方法收集5 BV流分，并測(cè)定5 BV流分中小檗堿的總量。如圖5所示，小檗堿洗脫量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，但當(dāng)乙醇增至90%時(shí)，洗脫的小檗堿的量明顯降低。這和小檗堿自身的性質(zhì)有關(guān)，其在高體積分?jǐn)?shù)的乙醇條件下溶解性能較差。另外，收集流分過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在90%乙醇洗脫液中出現(xiàn)明顯的渾濁狀。因此后續(xù)試驗(yàn)中選擇70%的乙醇溶液作為洗脫液。

圖5 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of eluent concentration

2.4.4 洗脫劑用量的考察 由圖6曲線可知，在用70%乙醇洗脫的過(guò)程中，前3 BV的洗脫液已可將絕大部分小檗堿解吸下來(lái)，所獲小檗堿的質(zhì)量濃度分別為4.78、2.73、0.42 mg/mL;而在第4 BV洗脫液中，小檗堿的質(zhì)量濃度＜0.16 mg/mL，到了第5 BV時(shí)則檢測(cè)不出洗脫液中含有小檗堿。因此，為節(jié)約成本，減少洗脫劑的損耗，故確定洗脫劑70%乙醇的用量為3 BV。

圖6 小檗堿解吸曲線Fig.6 Berberine desorption curves

2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在優(yōu)化的工藝條件下對(duì)川黃連提取液中的小檗堿進(jìn)行除雜純化，即以8.7 mg/mL濕樹(shù)脂小檗堿上樣，先用3 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再用3 BV的70%的乙醇解吸小檗堿，整個(gè)分離純化過(guò)程控制體積流量為1.0 mL/min，經(jīng)AB－8樹(shù)脂分離純化后，其干固物中小檗堿的純度從19.3%提高至73.2%，目標(biāo)物小檗堿的回收率為91.3%。有文獻(xiàn)報(bào)道，用D101大孔樹(shù)脂純化黃連總生物堿，純化后的黃連總生物堿純度約為70%［17］。相比之下，本純化工藝操作更簡(jiǎn)單，純化效果好，可直接獲得黃連中有效成分小檗堿的純化物。

3 結(jié)論

本研究采用溫控式微波化學(xué)反應(yīng)器微波輔助回流提取川黃連中的小檗堿。并通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)黃連小檗堿的提取工藝進(jìn)行考察，獲得最佳提取工藝條件為微波回流10 min，提取溫度80℃，50%乙醇，料液比1∶25，提取次數(shù)2。結(jié)果表明，在優(yōu)化的提取條件下，小檗堿的提取率為8.5%，高于傳統(tǒng)的單純回流提取和水浴加熱提取的提取率。此外微波輔助回流法快速、操作成本低，可減少原料預(yù)處理費(fèi)，且對(duì)環(huán)境無(wú)害。

為進(jìn)一步純化小檗堿，本研究還利用AB－8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)川黃連中的小檗堿進(jìn)行分離純化，得到最佳分離純化條件為:小檗堿上樣量為8.7 mg/mL濕樹(shù)脂，用3 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再用3 BV的70%的乙醇解吸小檗堿，整個(gè)分離純化過(guò)程，控制體積流量為1.0 mL/min。在此純化工藝下，川黃連醇提液分離純化前后干固物中小檗堿的純度從19.3%提高到73.2%，回收率達(dá)91.3%。本純化工藝，操作更簡(jiǎn)單，在不需要調(diào)節(jié)pH值條件下，對(duì)小檗堿的分離純化效果更好。另外，由于大孔樹(shù)脂可反復(fù)利用，成本較低，生產(chǎn)周期較短，適宜大規(guī)模生產(chǎn)。

因此，本研究工作將有望應(yīng)用于鹽酸小檗堿的提取工業(yè)中，為黃連資源的工業(yè)化應(yīng)用起到一定的促進(jìn)作用。

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