羥基喜樹堿/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物凝膠骨架緩釋片的制備及體外釋放

宋文霞， 索緒斌*， 鄧妍芳， 黃旖旎， 張 涵

(1.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州 510006;2.廣州市茗川生物科技有限公司，廣東廣州， 510006)

羥基喜樹堿 (10-hydroxycamptothecine，HCPT)是我國特有的珙垌科喬木喜樹種子中分離提取的一種純天然微量生物堿［1］，通過選擇性抑制拓撲異構酶Ⅰ而干擾DNA的復制，具有高效低毒、廣譜抗癌的特點［2］，且與其他常用抗腫瘤藥無交叉耐藥性。臨床用于膀胱癌、直腸癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、白血病及頭頸部腫瘤等，均具有非常好療效［3-4］。羥基喜樹堿由于水溶性差，生物利用度較低，臨床上使用鈉鹽注射液，但由于其α-羥基內酯環(huán)易打開，表現(xiàn)出極低的抗拓撲異構酶Ⅰ的活性，限制了其在臨床上的應用［5］。目前羥基喜樹堿的制劑研究主要集中于片劑，膠囊，凍干粉針劑，納米粒，脂質體，乳劑，固體分散體等劑型［6］，其緩釋制劑未見報道，對于難溶性藥物緩釋制劑而言，其最大的問題就是藥物的釋放。本項目為了改善羥基喜樹堿緩釋制劑的體外釋放的行為，降低在中性環(huán)境中HCPT開環(huán)比例。本實驗采用羥丙基-β-環(huán)糊精 (HP-β-CD)將藥物包合后，然后制成羥基喜樹堿/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(HCPT/HP-β-CD)凝膠骨架緩釋片，可以有效保護HCPT結構中 E環(huán)上的 α-羥基內酯環(huán)［7］，利用HP-β-CD對HCPT包合作用的增溶性［8-9］，可以持續(xù)緩慢釋放藥物，達到《中國藥典》對緩釋制劑的技術要求。

1 實驗材料

1.1 儀器 759MC紫外可見分光光度計 (上海菁華科技儀器有限公司)，BSA124S電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);PHS—3C pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司);KQ5200B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);101—1AB型電熱鼓風干燥箱 (天津市泰斯特儀器有限公司);CDR—4P型差示熱分析儀 (上海精密儀器有限公司);ZRS—8G智能溶出測試儀 (天津市新天光分析儀器技術有限公司)。

1.2 試劑 10-羥基喜樹堿 (HCPT)(成都天源天然產物有限公司，批號:120803，純度＞99.0%，高效液相面積歸一法測定);HP-β-CD(湖北興銀河化工有限公司);N，N-二甲基甲酰胺 (天津市廣成化學試劑有限公司);HPMC(上?？房蛋录夹g有限公司);淀粉;糊精;微晶纖維素;微粉硅膠;硬脂酸鎂;雙蒸水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的制備

精密稱取4.0 mg HCPT，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L NaOH溶液定容至刻度，作對照品貯備液。制備質量濃度分別為 0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5 g/L等一系列對照品溶液，以0.1 mol/L NaOH為空白溶液，用紫外可見分光光度計于420 nm處檢測，以藥物的質量濃度對吸光度(A)進行回歸，得線性回歸方程。HCPT線性回歸方程為A=45.812C+0.141 7，相關系數(shù)r=0.996 8，結果表明在所選定的質量濃度范圍內，其吸光度與質量濃度線性關系良好。線性范圍為0.002 5～0.04 g/L。

2.2 HCPT/HP-β-CD 包合物的制備［10］

取10 mL小瓶加入適量的羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)，用乙醇溶液使溶解，加入用少量的N，N二甲基甲酰胺溶解的HCPT溶液，滴入少許的冰醋酸，置于水浴超聲中超聲一定時間，取出置于蒸發(fā)皿中研磨至干，加入少量水溶液 (pH=4)研磨［11］，微孔濾膜過濾，得澄清透明的溶液，即為HCPT/HP-β-CD包合物的水溶液，收集濾膜上未包合的游離藥物，供測。

2.3 HCPT/HP-β-CD包合物包合率的測定

取濾膜上未包合的游離藥物，置于10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液定容至刻度，溶液由無色變?yōu)辄S色，以0.1 mol/L NaOH為空白溶液，用紫外可見分光光度計于420 nm處檢測的藥物吸光度 (A)。根據(jù)下面的公式計算其包合率 (inclusion rate，DR):

式中:W未包合為濾膜上未包合的游離HCPT的質量，W總為HCPT總質量。

2.4 均勻設計優(yōu)化最優(yōu)工藝處方

按照上述的HCPT/HP-β-CD包合物制備方法，經過多次單因子對比試驗均勻設計實驗的影響因素為N，N-二甲基甲酰胺用量 (A)、羥丙基-β-環(huán)糊精的用量 (B)、水的酸堿度 (C)、乙醇體積分數(shù)(D)、超聲時間 (E)等五個因素，每個因素分10個水平。選用U10(108)均勻設計表安排實驗方案，以包合率作為實驗考察的指標，優(yōu)選出最佳處方。

均勻設計得出的線性方程如下:Y=0.012 72－0.009 09X1+0.002 09X2－0.002 59X3+0.015 46X4+0.001 20X5－0.000 06X22，相關系數(shù)R2=0.955 7，其中X1，X2，X3，X4及X5分別為N，N-二甲基甲酰胺，HP-β-CD的用量，酸堿度，乙醇的體積分數(shù)及超聲時間。根據(jù)該線性方程，最佳條件為N，N-二甲基甲酰胺用量是0.11 mL，HP-β-CD的用量是17.42 mg，pH為3.67，75%乙醇，超聲時間是13 min。采取最佳工藝處方，制得的HCPT/HP-β-CD包合物的包合率達80%以上，達到預期目標。

2.5 HCPT/HP-β-CD 包合物的驗證［12］

2.5.1 差示熱驗證試驗 分別取 HCPT、HP-β-CD、包合物及二者的混合物進行差示掃描熱分析，以Al2O3為參比，各樣品約取5.0mg，量程為+30 μV，升溫范圍為30～300℃，升溫速率為 10℃/min，作差熱分析 (DSC)圖譜，見圖1。

各樣品的差示熱分析圖表明，HCPT(d)在100、270℃左右各有一個峰分別是水峰和熔融峰，HP-β-CD(c)在70℃左右有一水峰，物理混合物(b)保持了HCPT的水峰和熔融峰，基本上是HCPT和HP-β-CD的疊加，包合物 (a)圖譜上無HCPT的水峰和熔融峰。說明包合物已經形成。

2.5.2 紅外光譜驗證試驗 分別取HCPT、HP-β-CD、包合物及二者的混合物適量，樣品碘化鉀壓片后，做紅外圖譜 (IR)，見圖2。

由紅外圖譜可見，包合物 (b)和混合物 (a)的IR圖譜明顯不同，HCPT(d)的特征峰在包合物中不再顯示，包合物 (b)的圖譜和HP-β-CD(c)的圖譜相似。結果說明 HCPT被 HP-β-CD包裹。

圖1 HCPT/HP-β-CD包合物的差示熱分析圖Fig.1 DSC diagramme of HCPT/HP-β-CD inclusion

圖2 HCPT/HP-β-CD包合物的紅外光譜圖Fig.2 Infra-red spectrogram of HCPT/HP-β-CD inclusion

2.6 包合物凝膠骨架緩釋片的制備［13］

按照上述制作包合物的方法，根據(jù)均勻設計篩選出的最優(yōu)處方制備出HCPT/HP-β-CD包合物溶液，再用研缽研磨使成糊狀，置于烘干箱烘3～4 h，得白色干燥的粉末。取包合物粉末適量，加入8%羥丙甲纖維素 (HPMC K15)及其他一些如淀粉，糊精，微晶纖維素等輔料，分別過60目篩后，混合均勻，用75%乙醇溶液作潤濕劑，混合濕法制備顆粒，過20目篩得均勻的顆粒，置于60℃干燥箱干燥5～6 h，過20目篩整粒，加入1%硬脂酸鎂壓片得包合物凝膠骨架緩釋片。

2.7 片劑中的藥物的體外釋放［14］

配制溶出介質 (生理鹽水)250 mL置于溶出杯中，調節(jié)轉速為100 r/min，溫度為37℃。當溶出杯中溶出介質的溫度為37℃時。將精密稱定質量的藥片放入溶出杯中進行溶出，分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25 h取樣，每次取樣5 mL(同時補充相同溫度同體積溶出介質)，加入0.1 mol/L NaOH溶液定容至10 mL，超聲一定時間，使藥物從HP-β-CD中完全釋放，繼續(xù)按照測定包合率的方法測吸光度，代入標準曲線，計算藥物濃度和藥物的累積釋放百分率，制作溶出曲線，見圖3。

圖3 HCPT/HP-β-CD包合物及HCPT凝膠骨架緩釋片的體外釋放溶出曲線圖Fig.3 In vitro release of HCPT/HP-β-CD inclusion and HCPT gel matrix sustained-release tablets

2.8 藥物體外釋藥模型擬合與結果

2.8.1 藥物體外釋藥模型擬合 關于藥物的釋放模型，人們做了大量的探究的研究，建立起諸多的模型體系。藥物釋放，方程是Fick擴散定律為基礎而提出的，這些藥物釋放過程是在一些邊界條件和假設的基礎上得到的Fick擴散定律近視解，常見的藥物釋放模型如下:

其中，t為時間，Mt為t時刻的藥物釋放量，M∞為最大藥物釋放量，Mt/M∞為t時刻的累計釋放百分數(shù);k是藥物釋放速度常數(shù)，隨著不同藥物或不同處方以及不同釋放條件而變化;c為系數(shù);n為釋放常數(shù)，是表征釋放機制的特征參數(shù)，與片劑的形狀有關，對于圓柱形制劑，當n＜0.45時，為Fick擴散;當0.45＜n＜0.89時，藥物釋放擴散與溶蝕協(xié)同作用;當n＞0.89時，為溶蝕作用。

2.8.2 藥物體外釋藥模型擬合結果 根據(jù)HCPT/HP－β-CD包合物及HCPT凝膠骨架緩釋片的體外釋放溶出曲線圖，進行各個釋放模型擬合，見圖4和圖5。

圖4 HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架緩釋片體外釋放模型擬合圖Fig.4 In vitro release model fitting of HCPT/HP-β-CD inclusion gel matrix sustained-release tablets

圖5 HCPT凝膠骨架緩釋片體外釋放模型擬合圖Fig.5 In vitro release model fitting of HCPT gel matrix sustained-release tablets

表1 包合物及游離藥物的凝膠骨架緩釋片體外釋放模型擬合結果Tab.1 In vitro release model fitting of HCPT/HP-β-CD inclusion and HCPT gel matrix sustained-release tablets

由各模型結果可知，一級模型，Higuchi模型，Ritger-Peppas模型的釋放度與時間有良好的相關性，以R值最大為優(yōu)。由以上結果可見，兩種緩釋片的體外釋放均為一級釋放模型。HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架緩釋片的Ritger-Peppas體外釋放模型擬合釋放參數(shù)n=0.422 0＜0.45，而HCPT凝膠骨架緩釋片的Ritger-Peppas體外釋放模型擬合釋放參數(shù)為n=0.714 4，說明HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架緩釋片的體外釋放為Fick擴散，而HCPT的凝膠骨架緩釋片的體外釋放符合藥物釋放擴散與溶蝕協(xié)同作用。

3 討論

3.1 HCPT在酸性 (pH≤4.0)條件下主要以內酯的結構存在，在弱堿性條件下主要以開環(huán)結構存在，親水性強;環(huán)糊精分子是略呈錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結構，在其空洞結構中，外側上端 (較大開口端)由C2和C3的仲羥基構成，下端 (較小開口端)由C6的伯羥基構成，具有親水性，空腔內由于受到C-H鍵的屏蔽作用形成了疏水區(qū);因此適當?shù)乃嵝原h(huán)境有利于保護藥物內酯結構，從而有利于藥物HP-β-CD包合物的形成。

3.2 實驗過程中包合物的制備方法采用了飽和水溶液法和超聲波法相結合的方法，HCPT在水中基本不溶，加入N，N-二甲基甲酰胺可使之完全溶解成澄清溶液，加入高濃度的HP-β-CD溶液，溶液會輕微的渾濁，表示藥物達到了過飽和，此時置于水浴超聲中，有利于HCPT進入HP-β-CD疏水性空洞內，形成包合物。在對比N，N-二甲基甲酰胺與乙醇對藥物溶解及最終形成包合效果而言，發(fā)現(xiàn)N，N-二甲基甲酰胺要明顯優(yōu)于乙醇，因此在本實驗中選擇N，N-二甲基甲酰胺作為藥物的溶解劑。

3.3 在包合物緩釋凝膠骨架片釋放的過程中，對于釋放出的藥物檢測，采取了堿性溶液加超聲的方法，目的在于將藥物完全從HP-β-CD釋放出來。在前期驗證的實驗中，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時間延長，樣品紫外吸收值會增長，其原因可能是超聲可以加速藥物從包合物中出來進入強堿性溶液中，所以在HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架緩釋片釋放檢測的過程，超聲環(huán)節(jié)必不可少。

3.4 HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架片在本實驗中能持續(xù)緩慢釋放藥物，而HCPT凝膠骨架片釋放，藥物釋放為非漏槽條件，在釋放介質中很快達到飽和，藥物以游離分散于釋放介質中。在檢測中，由于取樣有濾膜過濾，溶液中游離藥物未能進入檢測環(huán)節(jié)，HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架片的藥物釋放量要明顯高于單純的HCPT凝膠骨架片。另外HCPT/HP-β-CD包合物凝膠骨架緩釋片藥物的釋放遵循Fick擴散規(guī)律，而HCPT凝膠骨架緩釋片的釋放藥物釋放擴散與溶蝕協(xié)同作用。這可能與HP-β-CD的包合增強了藥物的親水性和水溶性有關。

［1］Zhang Ruiwen，Li Yufeng，Qiuyin Cai，et al.Preclinical pharmacology of the natural product anticancer agent 10-hydroxycamptothecin，an inhibitor of topoisomerase I［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1998，41(4):257-267.

［2］楊 眉，曾裕建.喜樹堿及其衍生物的研究進展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2003，19(8):977-978.

［3］Zhou J J，Liu J，Xu B.Relationship between lactone ring forms of HCPT and their antitumor activities［J］.Acta Pharmacol Sin，2001，22(9):827.

［4］李 蘇，張 力，管忠震，等.羥基喜樹堿片在腫瘤患者體內的絕對生物利用度［J］.中國臨床藥理學雜志，2005，21(1):46-49.

［5］翁蠅美，胥 彬.喜樹堿類抗癌物質對拓撲異構酶I的作用研究進展［J］.腫 瘤，1991，11(2):74-77.

［6］齊 菲.羥基喜樹堿劑型的研究進展［J］.中國藥業(yè)雜志，2005，14(9):93-94.

［7］周建軍，劉 健，徐 斌.羥基喜樹堿內酯形式與其抗癌活性的關系［J］.中國藥理學報，2001，22(9):827-830.

［8］馬雪琴，董 琳，李國珊，等.環(huán)糊精的包合作用對羥基喜樹堿活性內酯結構的保護［J］.中國新藥雜志，2010，19(14):1270-1274.

［9］宋金春，陳佳麗，黃 嶺.2-羥丙級-β-環(huán)糊精對羥基喜樹堿的增溶及穩(wěn)定作用研究［J］.中國藥房，2008，19(4):269-272.

［10］周立國，魏鳳玲.β-環(huán)糊精包和技術及應用［J］.醫(yī)學創(chuàng)新研究，2006，3(3):31-33.

［11］Greenwald R B，Choe Y H ，Wu D.Selective phenolic acylation of 10-hydroxycamptothecin using poly(ethylene glycol)carboxylic acid［J］.Bioor Med Chem Lett，2003，13(3):577-580.

［12］馬雪琴，任 勇，付雪艷.羥基喜樹堿/羥丙級-β-環(huán)糊精包合作用研究［J］.中國新藥雜志，2007，16(17):1385-1387.

［13］崔福德.藥劑學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007，431-440.

［14］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版二部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅩD.