鉤藤堿對腎性高血壓大鼠心肌中葉素及其受體表達的影響

汪江濤， 丁伯平， 柏 松， 陳 莉， 黃幀檜

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國家三級實驗室，安徽蕪湖 241002)

中葉素是美國斯坦福大學(xué)Roh等［1］運用生物信息學(xué)理論所發(fā)現(xiàn)的一個降鈣素基因相關(guān)肽 (calcitonin gene－related peptide，CGRP)家族的新的血管活性肽，與日本學(xué)者2004年發(fā)現(xiàn)的腎上腺家族的新肽腎上腺髓質(zhì)素2(adrenomedullin2，ADM2)在核苷酸和氨基酸序列上完全相同，認為兩者是同一物質(zhì)［2］，具有舒張血管、降低血壓、保護心功能等生物學(xué)效應(yīng)［3－4］，中葉素可與任意一種 CGRP家族特異性受體復(fù)合物結(jié)合，該受體復(fù)合物由降鈣素受 體 樣 受 體 (calcitonin receptor－like receptor，CRLR)和受體活性修飾蛋白 (receptor activity modifying proteins，RAMPs)構(gòu)成，包括 CRLR/RAMP1、CRLR/RAMP2、CRLR/RAMP3，是重要的心血管保護因子之一。鉤藤為茜草科植物鉤藤或華鉤藤及其同屬的多種植物的帶鉤枝條，鉤藤堿為其主要有效活性成分［5］，具有降壓、鎮(zhèn)靜等作用［6－7］。但鉤藤堿對腎性高血壓心肌保護報道較少，本實驗在兩腎一夾腎性高血壓大鼠模型的基礎(chǔ)上，初步探討鉤藤堿心肌保護是否與內(nèi)皮素 (ET－1)和中葉素及其受體表達有關(guān)，為鉤藤堿臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，購自南京青龍山實驗動物中心，許可證號:SCXK(滬)2008－0016，分籠飼養(yǎng)，每籠一只，保持溫度 (25±2)℃，相對濕度60% ±10%，自由進食飲水。

1.2 藥品與試劑 98%鉤藤堿 (南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，批號:ZL110715);尼卡地平 (安斯泰來制藥 (中國)有限公司，批號:B027Y01)。羥脯氨酸 (Hyp)檢測盒 (南京建成生物工程研究所，批號:20111120);內(nèi)皮素 (ET－1)放射免疫藥盒，北京北方生物技術(shù)研究所 (批號:20111120);大鼠降鈣素受體樣蛋白 (CRLR)ELISA檢測試劑盒 (蘇州卡爾文生物工程有限公司，批號:CK－E91835R)。兔抗中葉素多克隆抗體(編號:bs－2985R，批號:990292)，SP免疫組化檢測試劑盒 (兔)(編號:SP－0023)，DAB試劑盒均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TRNzol－A+，RNase－free ddH2O，超純 dNTP，Oligo dt15均購于天根生化科技 (北京)有限公司 (批號分別為#J9117;#L0517;#L0314;#L0301);PCR引物由南京金斯瑞生物工程科技有限公司合成。

1.3 儀器 GC—1200型γ放射免疫計數(shù)器 (科大股份公司);KDC—2042恒溫高速離心機 (科大股份公司);EG1160組織包埋機 (德國LEICA);RM2245組織切片機 (德國LEICA);Elx 800全自動酶標儀 (美國寶特儀器有限公司);勻漿儀(PRO 250);JD801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng) (江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司);高速冷凍離心機(Heraeus);基因擴增儀EDC—810(東勝國際貿(mào)易有限公司);瑞士產(chǎn)微量加樣儀;瑞士產(chǎn)連續(xù)加樣儀。

1.4 兩腎一夾高血壓模型的復(fù)制及處理 60只雄性清潔級SD大鼠，觀察適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機抽取8只作為假手術(shù)組，52只為造模組，對造模組大鼠進行兩腎一夾手術(shù)，大鼠術(shù)前禁食過夜，自由飲水。以25%烏拉坦 (4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，玻璃分針分離左腎動脈，放置內(nèi)徑為0.20 mm的銀夾打結(jié)并固定。假手術(shù)組同樣分離腎動脈，但不放置銀夾，依次縫合肌肉和皮膚。手術(shù)后4 h內(nèi)肌肉注射40萬單位的青霉素，連續(xù)注射3 d以預(yù)防感染，術(shù)后正常進食與喂水。無創(chuàng)尾動脈血壓測量儀測定正常大鼠清醒手術(shù)前、手術(shù)后及用藥后尾動脈壓。手術(shù)后4周收縮后達160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)為造模成功［8］，入選給藥組。將造模成功的大鼠隨機分為5組 (見表1):模型組 (n=8)、鉤藤堿高劑量組 ［10.0 mg/(kg·d)，n=8］、鉤藤堿中劑量組 ［5.0 mg/(kg·d)，n=8］、鉤藤堿低劑量組 ［2.5 mg/(kg·d)，n=8］、尼卡地平組 ［0.1 mg/(kg·d)，n=8］。手術(shù)后5周開始給藥，鉤藤堿高、中、低劑量組和尼卡地平組腹腔注射給藥連續(xù)8周;模型組和假手術(shù)組腹腔注射等量的生理鹽水。

表1 大鼠造模后的收縮壓、舒張壓變化 (mmHg，±s，n=8)Tab.1 Changes of systolic pressure and diastolic pressure(mmHg，±s，n=8)

表1 大鼠造模后的收縮壓、舒張壓變化 (mmHg，±s，n=8)Tab.1 Changes of systolic pressure and diastolic pressure(mmHg，±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，ΔΔP＜0.01。

組 別 劑量/(mg·kg －1)術(shù)后4周收縮壓 舒張壓假手術(shù)組115.7±9.2 80.2±9.1模型組 169.8±11.2ΔΔ130.3±11.6ΔΔ鉤藤堿高劑量組 10.0 171.1 ±9.8ΔΔ 132.3±13.6ΔΔ鉤藤堿中劑量組 5.0 170.7±10.8ΔΔ133.9±12.2ΔΔ鉤藤堿低劑量組 2.5 172.6±12.6ΔΔ131.9±10.6ΔΔ尼卡地平組 0.1 170.3±14.3ΔΔ 129.7±9.6ΔΔ

1.5 全心質(zhì)量指數(shù) (HM/BM)的測定和心肌Hyp、ET－1、CRLR的測定 給藥8周后稱定質(zhì)量處死，迅速開胸取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗后濾紙吸干，稱量全心質(zhì)量 (mg)和大鼠體質(zhì)量(g)，計算全心質(zhì)量指數(shù);準確稱取心肌組織，按質(zhì)量體積比1∶9加0.86%冷生理鹽水，制成10%的組織勻漿，4℃，3 000 r/min離心10 min，分離上清液后用堿水解法測定Hyp的水平，放射免疫法測定ET－1水平，ELISA法測定 CRLR水平，勻漿制備過程在4℃條件下進行，并在15 min內(nèi)完成。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測中葉素在心肌組織中蛋白的表達 心肌組織置入10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟入水，30%H2O21份和蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次;將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液 (pH 6.0)，高壓鍋加熱至沸騰后斷電，間隔10 min，反復(fù)2次，冷卻后用PBS(pH 7.2)洗滌2次;滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗;滴加兔抗中葉素單克隆抗體(1∶150)，4℃孵育過夜;PBS(pH7.2)洗5 min 3次;滴加二抗37℃放置30 min，PBS(pH7.2)洗5 min 3次;滴加試劑SABC，37℃ 30 min，PBS(pH 7.2)洗5 min 4次;使用DAB顯示試劑盒，室溫顯色，顯微鏡下觀察染色程度，蒸餾水洗滌終止反應(yīng);蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢。結(jié)果判定:低倍鏡和高倍鏡觀察切片，組織細胞結(jié)構(gòu)清晰的為陽性細胞，胞漿染成棕黃色。應(yīng)用IPP 6.0對結(jié)果進行半定量分析，以累計光密度值(IOD)進行比較。

1.7 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)分析RAMPs mRNA表達 大鼠處死后迅速去心肌組織100 mg，用 Trizol一步提取法提取組織的總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入RNA 2 μg，10×RT Mix 2 μL，dNTP 混合液 2 μL，Oligo－dT152 μL，Quant Reverse Transcriptase 1 μL，最后加入 RNasefree水，使反應(yīng)總體積達到20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在37℃下反應(yīng)60 min，在70℃下15 min使產(chǎn)物變性。引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系如下［9］:1 μL 模板 cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，加入雙蒸水使反應(yīng)總體積達到25 μL。RAMP1和 RAMP2反應(yīng)條件:變性94℃4 min;擴增 (31個循環(huán)):94℃30 s，60℃ 45 s，72℃ 35 s;末次循環(huán)后，72℃再延伸5 min;RAMP3反應(yīng)條件:變性94℃4 min;擴增 (33個循環(huán)):94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 35 s;末次循環(huán)后，72℃再延伸5 min;?actin反應(yīng)條件:變性94℃4 min;擴增 (25個循環(huán)):94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 35 s;末次循環(huán)后，72℃再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物8 μL加5×Loading Buffer 2 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析心肌組織中RAMP1、RAMP2和RAMP3 mRNA的表達，結(jié)果以目的條帶的光密度與相關(guān)β－actin mRNA光密度的比值表示。

表2 RT-PCR擴增的寡核苷酸引物及反應(yīng)條件Tab.2 Oligonucleotides used for the amplification and reaction conditions

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件分析，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠 HM/BM、Hyp、ET－1、CRLR的變化給藥8周后，與假手術(shù)組相比，模型組HM/BM、Hyp、ET－1、CRLR均有顯著提高 (P＜0.01);與模型組相比，鉤藤堿高、中劑量組及尼卡地平組HM/BM、Hyp、ET－1下降，CRLR上升，差異有顯著性 (P＜0.01)，低劑量組能一定程度的降低HM/BM，升高CRLR(P＜0.05)，見表3。

2.2 心肌組織中中葉素的蛋白表達 通過免疫組化染色可以看出，中葉素主要表達在心肌組織的胞漿中，與假手術(shù)組相比，中葉素在模型組大鼠心肌組織的中表達升高58.65%(P＜0.01);與模型組相比，鉤藤堿高、中、低劑量組和尼卡地平組在心肌組織中中葉素蛋白水平的表達分別升高1.95倍、97.07%、27.92%和1.91倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1，表4。

表3 各組HM/BM、Hyp、ET-1、CRLR的變化 (±s，n=8)Tab.3 Changes of HM/BM，Hyp，ET-1，CRLR in all groups(±s，n=8)

表3 各組HM/BM、Hyp、ET-1、CRLR的變化 (±s，n=8)Tab.3 Changes of HM/BM，Hyp，ET-1，CRLR in all groups(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 全心質(zhì)量指數(shù)/(mg·g－1) 羥脯氨酸/(mg·g－1) 內(nèi)皮素/(pg·mL－1) 降鈣素受體樣蛋白(pg·mL－1)假手術(shù)組2.77±0.19 0.44±0.08 3.17±0.46 210.8±17.1模型組 3.61±0.22ΔΔ 0.87±0.11ΔΔ 6.25±0.72ΔΔ 275.5±19.9ΔΔ鉤藤堿高劑量組 2.92±0.23★★ 0.47±0.09★★ 3.37±1.02★★ 452.5±20.5ΔΔ★★鉤藤堿中劑量組 3.05±0.24Δ★★ 0.68±0.11ΔΔ★★ 4.54±1.31Δ★★ 389.5±23.2ΔΔ★★鉤藤堿低劑量組 3.32±0.21ΔΔ★ 0.81±0.08ΔΔ 5.63±0.98ΔΔ 300.3±20.8ΔΔ★尼卡地平組 2.87±0.24★★ 0.46±0.09★★ 3.32±0.85★★ 453.9±21.1ΔΔ★★

圖1 各組大鼠心肌組織中中葉素的蛋白表達 (×400)Fig.1 Intermedin level in myocardium protein expression in all groups

表4 各組大鼠心肌組織中葉素的蛋白表達(以累積光密度進行比較)(±s，n=8)Tab.4 Intermedin level in myocardium protein expressionin all groups(compared with IOD)(±s，n=8)

表4 各組大鼠心肌組織中葉素的蛋白表達(以累積光密度進行比較)(±s，n=8)Tab.4 Intermedin level in myocardium protein expressionin all groups(compared with IOD)(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 心肌中葉素蛋白表達水平假手術(shù)組11 833.1±1 994.6模型組 18 774.4±4 478.7△△鉤藤堿高劑量組 55 459.6±4 342.8△△★★鉤藤堿中劑量組 36 999.4±3 707.1△△★★鉤藤堿低劑量組 24 017.2±3 664.3△△★尼卡地平組 54 740.5±3 750.7△△★★

2.3 心肌組織中RAMPs mRNA表達的變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織的 RAMP1、RAMP2、RAMP3 mRNA的表達顯著提高 (P＜0.01);給藥后，與模型組相比，鉤藤堿高、中、低劑量組和尼卡地平組均能不同程度的提高RAMPs mRNA的表達，差異有顯著性 (P＜0.01或P＜0.05)，鉤藤堿給藥組對RAMP2、RAMP3 mRNA表達的上調(diào)更顯著，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織RAMPs mRNA的表達 (±s，n=8)Fig.2 Expression of RAMPs mRNA in myocardium in all groups(±s，n=8)

3 討論

近些年來研究表明血管活性肽在高血壓病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著極其重要的作用;中葉素是2004年新發(fā)現(xiàn)的一種血管活性肽，在心血管系統(tǒng)具有降低大鼠外周阻力［10］，舒張大鼠血管［11］，并且在減少心肌梗死面積、改善心功能［3－4］以及心肌纖維化和心肌缺血損傷和中發(fā)揮著重要的作用［12－14］。腎性高血壓是一種由于腎動脈狹窄而造成腎血流量減少而激活腎素－血管緊長素系統(tǒng)(RAS)造成的一種常見的繼發(fā)性高血壓，存在明顯的心肌肥厚和纖維化，本實驗采用兩腎一夾方法復(fù)制繼發(fā)性高血壓模型，采用鉤藤堿和尼卡地平進行干預(yù)。結(jié)果顯示:造模后，HM/BM、Hyp均有顯著提高，反映了心肌細胞的增生與肥厚及纖維化程度;心肌組織中ET－1、CRLR、中葉素及RAMPs mRNA的表達升高，提示在腎性高血壓時機體代償性增加中葉素的水平，其與賈月霞等［15］報道基本一致;給藥后，鉤藤堿各劑量均能不同程度的降低HM/BM、Hyp，顯示其具有心肌保護的作用。而ET－1水平降低，CRLR、中葉素及 RAMPs mRNA的表達升高，提示給藥鉤藤堿后機體可能通過上調(diào)心肌中葉素及其受體的表達和降低ET－1的水平來對抗高腎素和AngⅡ引起心臟負荷增加等效應(yīng)，產(chǎn)生心肌保護作用。

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