RP-HPLC法測(cè)定解肌寧嗽丸中甘草苷、葛根素、柚皮苷、橙皮苷

王 坤， 謝強(qiáng)勝

(山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南 250101)

解肌寧嗽丸一方來源于《沈氏尊生書》寧嗽湯加減，后收錄在《北京市中藥成方選集》，主治相同?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2010年版一部［1］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中定量測(cè)定是以柚皮苷為指標(biāo)［1-2］，測(cè)定枳殼中柚皮苷［3-4］。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)報(bào)道［10-12］，建立了同時(shí)測(cè)定解肌寧嗽丸中有效成分橙皮苷［5-6］、柚皮苷［7］、葛根素、甘草苷［8-9］的定量測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可用于解肌寧嗽丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695-2996液相色譜儀;METTLER AE240電子天平 (瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥 甘草苷 (批號(hào)111610-200401)、葛根素 (批號(hào)110752-200209)、柚皮苷 (批號(hào)110722-200309)、橙皮苷 (批號(hào)110721-200211)對(duì)照品均購(gòu)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇 (分析純、色譜純);解肌寧嗽丸 (天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠)，為大蜜丸。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 Diamonsil ODS C18色譜柱 (250 mm×4.5 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇－0.1%磷酸溶液 (25∶75);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm;柱溫為35℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草苷、葛根素、柚皮苷、橙皮苷10.05 mg、12.75 mg、20.30 mg、20.40 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取2、2、3、3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，制成20.1、25.5、60.9、61.2 μg/mL混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，混勻，取約2 g，精密稱定，置具塞錐型瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 (功率300 W，頻率40 kHz)45 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，即得。

2.4 陰性溶液的制備 取不加甘草、葛根、枳殼、陳皮的空白樣品按照供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法，制成溶液，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取上述對(duì)照品混合溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖1。4種成分分離度均大于2.0。理論板數(shù)以4個(gè)目標(biāo)成分計(jì)均不低于3 000。陰性樣品在4個(gè)目標(biāo)成分的色譜峰位置上無干擾，表明專屬性好。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品混合溶液4、8、12、16、20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果顯示在相應(yīng)進(jìn)樣量范圍內(nèi)，4個(gè)成分線性良好，結(jié)果見表1。

3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品混合溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積積分值。計(jì)算得甘草苷RSD為1.08%，葛根素RSD為0.75%，柚皮苷RSD為1.18%，橙皮苷RSD為0.34%。試驗(yàn)結(jié)果顯示儀器精密度良好。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、供試品 (B)和陰性對(duì)照 (C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixture standard substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

表1 4個(gè)成分線性測(cè)定結(jié)果Tab.1 Linearity of four components

3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 依2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備，按照樣品測(cè)定方法，對(duì)同一批號(hào)樣品進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示，甘草苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.36 mg/g，RSD為1.56%;葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25 mg/g;RSD為1.74%;柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.41 mg/g，RSD為1.18%;橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.72 mg/g，RSD為1.22%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣一次，每次10 μL，共考察12 h，以觀察樣品溶液在檢測(cè)過程中待測(cè)成分的穩(wěn)定性。計(jì)算得甘草苷RSD為1.47%，葛根素RSD為0.36%，柚皮苷RSD為1.19%，橙皮苷RSD為0.87%%。說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取3.3項(xiàng)下已測(cè)定的重量差異項(xiàng)下的樣品6份，每份約1.0 g，分別置50 mL量瓶中，精密加入甘草苷對(duì)照品溶液 (0.58 mg/mL)、葛根素對(duì)照品溶液 (0.21 mg/mL)，柚皮苷對(duì)照品溶液 (1.60 mg/mL)，橙皮苷對(duì)照品溶液 (1.90 mg/mL)混合對(duì)照品1 mL，加入50%甲醇至刻度，超聲處理 (功率300 W，頻率40 kHz)45 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。按2.1項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算回收率，結(jié)果表明本法具有良好的回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

3.6 樣品的測(cè)定 按2.3項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，精密量取上述混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定4個(gè)成分，按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表3。

4 討論

4.1 色譜條件的優(yōu)化 原《中國(guó)藥典》甘草、葛根、枳殼、陳皮項(xiàng)下流動(dòng)相為甲醇-水、乙腈-水、甲醇－0.1%磷酸水溶液，從色譜結(jié)果看，甲醇－0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相測(cè)定時(shí)理論板數(shù)及拖尾因子結(jié)果最理想，加入酸有利于減少拖尾，故最終確定以甲醇－0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

4.2 吸收波長(zhǎng)的選擇 為了保證被測(cè)組分具有適宜靈敏度和精密度，本課題組測(cè)定了橙皮苷、柚皮苷、葛根素、甘草苷在流動(dòng)相中紫外吸收光譜，甘草苷在277 nm有最大吸收;葛根素在250 nm處有最大吸收，柚皮苷［11］和橙皮苷在283 nm處有最大吸收。經(jīng)過研究確定283 nm為本實(shí)驗(yàn)的吸收波長(zhǎng)。在283 nm條件下，建立以上定量測(cè)定方法，該方法穩(wěn)定可靠。

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